氟啶酮对刚地弓形虫出胞及其宿主细胞的影响

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1、重庆医科大学硕士学位论文氟啶酮对刚地弓形虫出胞及其宿主细胞的影响姓名：孔璟申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：叶彬201205重庆医科大学硕士研究生学位论文氟啶酮对刚地弓形虫出胞及其宿主细胞的影响摘要研究背景及目的：刚地弓形虫(‰印伽脚臼gD，2旃7，r90刀功f)是在细胞内寄生的原虫之一，其生命周期主要包括侵入细胞、细胞内繁殖、逸出细胞、侵入新的细胞几个步骤。其中，入侵机制已有大量的研究，但如何从宿主细胞中外出还研究得较少。弓形虫速殖子从宿主细胞中出胞是一个连续的过程，研究发现这一过程需要脱落酸(Abscisicacid，ABA)作为

2、出胞启动的信号分子，并分泌刚地弓形虫穿孔素样蛋白(陬op伽聊口go船西fperforin—l汰eproteins，T萨LPl)；推测弓形虫体内可能存在合成内源性ABA的相关基因。又有研究发现外源性ABA可以诱导肿瘤细胞发生凋亡。本课题组前期的研究表明弓形虫能使宿主细胞发生明显的细胞周期阻滞及凋亡。本文以弓形虫出胞依赖的信号分子作为切入点，采用ABA抑制剂氟啶酮(F1血done)作为干预手段，首先作用于细胞培养的弓形虫，利用形态学、分子生物学、细胞生物学等研究方法，探索氟啶酮对体外培养的弓形虫出胞的影响作用及其相关机制；试图发现弓形虫出胞与宿主细

3、胞细胞周期改变和凋亡间是否存在关联。其次，用氟啶酮作用于感染弓形虫的模型小鼠，从实验动物体内层面研究氟啶酮对弓形虫出胞的影响作用。’重庆医科大学硕士研究生学位论文方法：1．通过小鼠腹腔接种复苏刚地弓形虫RH株速殖子；建立虫体与Hela细胞的共同培养体系，分别以不同比例(依次为5：1、lO：1、20：1)的虫体接种细胞。分别取培养24h、48h、72h、96h的细胞进行吉姆萨染色，观察虫体在细胞内的增殖情况，计算感染率，确定适宜的虫体与细胞感染比例及培养时间。2．试验分组：对照组：Hela细胞和弓形虫共培养，培养基中PBS浓度为50“M：试验组：

4、以不同浓度(依次为：10、20、30、40、50nM)氟啶酮作用于Hela细胞培养的虫体。吉姆萨染色观察细胞内弓形虫形态，计数细胞内纳虫泡数目；RT-PCR检测ABA与T妒LPl基因表达水平的变化；SDS—PAGE电泳分析弓形虫T妒LPl蛋白表达水平的变化；ELISA检测培养上清中弓形虫内源性ABA的浓度变化。3．CCK．8比色法检测细胞增殖变化；收集对照组、试验组(氟啶酮浓度为30州，作用时间为72h)细胞，流式细胞术检测感染弓形虫的Hela细胞经氟啶酮作用后，细胞周期及细胞凋亡分布的变化。4．小鼠腹腔接种速殖子建立体内培养模型，以氟啶酮腹腔

5、注射处理试验组小鼠，对照组小鼠则以相同剂量生理盐水腹腔注射。另设药物毒性组，该组小鼠每天以相同剂量氟啶酮腹腔注射。观察小鼠生存时间、体重的变化；收集死亡小鼠脑、肝、脾、肺组织进行组织印片、吉姆萨染色后镜下观察、计数脏器内弓形虫感染情况；收集小鼠腹腔液和腹腔灌洗液，吉姆萨染色观察其中弓形虫形态变化，透射电镜、扫描电镜观察其超微结构。气重庆医科大学硕士研究生学位论文结果：1．油镜下观察吉姆萨染色标本，确定刚地弓形虫RH株速殖子在Hela细胞内寄生。细胞感染率与感染比例及培养时间有关。在一定范围内，感染比例一定时，感染率随着培养时间延长而增高；感染时

6、间一定时，感染率随着感染比例增大而增高。选定感染比例10：l，培养时间72h作为进一步实验参数。2．对照组：多数细胞受弓形虫感染，虫体在细胞内增殖，有部分细胞形态受到破坏。试验组：与对照组相比，细胞内虫体多形成纳虫泡，在一定范围内，纳虫泡数目随着氟啶酮浓度增高而增加(P

7、度的增高，培养上清中弓形虫内源性ABA的浓度是降低的。3．CCK-8细胞增殖抑制实验结果显示：细胞增殖抑制率与氟啶酮浓度有关，其浓度为30“M、作用72h时，宿主细胞抑制率是减小的(P

8、士研究生学位论文长(尸<0．05)，生存延长率为45％。试验组各脏器感染情况比对照组轻(P<0．05)。对照组小鼠腹腔中弓形虫多为游离的速殖子，试验组