超声微泡介导simdr1转染提高睾丸肿瘤化疗效果的实验研究

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1、重庆医科大学博士学位论文超声微泡介导siMDR1转染提高睾丸肿瘤化疗效果的实验研究姓名：何昀申请学位级别：博士专业：儿科学指导教师：魏光辉201205重庆医科大学博士研究生学位论文超声微泡介导siMORl转染提高睾丸肿瘤化疗效果的实验研究摘要睾丸肿瘤是生殖系统常见肿瘤，临床上恶性睾丸肿瘤化疗效果不佳是影响治疗结果的重要原因。研究发现与肿瘤多药耐药相关的P．糖蛋白在睾丸毛细血管内皮细胞上高表达形成一种生物学屏障，阻止化疗药物的进入，这可能在睾丸肿瘤的耐药中发挥了重要作用。如何突破这道屏障而逆转耐药，就成为睾丸肿

2、瘤治疗中的难点。本课题拟采用基因沉默的方法，用携带MDRl基因特异性小干扰RNA的真核表达质粒pSEB．siMDRl去抑制血管内皮细胞中P．糖蛋白的表达和功能，从而促进化疗药物进入睾丸组织中。但高效定向的体内基因转染是本研究的关键点，超声微泡的应用为实现体内靶向转染siMDRl基因提供了一种可靠的新方法。携带pSEB．siMDRl质粒的微泡，由静脉注入可通过循环到达睾丸，在超声作用下破坏微泡实现siⅧR1小干扰RNA体内向睾丸毛细血管内皮细胞的靶向转染，抑制P．糖蛋白表达和功能，为化疗药物进入睾丸内有效杀灭肿

3、瘤提供了条件，从而提高睾丸肿瘤治愈率。基于以上设想，本课题的研究内容包括以下4部分。第一部分携带siMDRl的真核表达质粒构建及功能鉴定目的：构建pSEB．siMDRl真核表达质粒，并通过检验其对内源性MDRl基因及P．糖蛋白表达和功能的抑制效果，筛选出有效的siMDRl4重庆医科大学博士研究生学位论文序列。方法：设计4对特异性针对大鼠MDRl基因的siRNA序列，退火后分别与pSEB．HUS质粒连接，重组获得pSEB．siMDRl真核表达质粒，PCR、酶切及测序鉴定插入片段。通过脂质体分别将4种pSEB．s

4、iMDRl转染到L2RYC细胞，并设置pSEB．HUS空质粒作为对照，以及等量混合共转染组(siMDRlP001)。转染48h后提取各组的总RNA和总蛋白，用real—timePCR及Western．blot检测MDRl的mRNA及蛋白表达，并用mT法检测转染后长春新碱对L2RYC细胞增殖的影响。结果：重组获得的4种pSEB。siMDRl经PCR扩增均可检测到约300bp的条带，pSEB-HUS空质粒对照无此条带；NotI酶切pSEB—HUS对照可获得1321bp和>5000bp条带各一条，重组成功的质粒仅有

5、>6000bp一条带。重组质粒送测序，结果与所设计的siRNA序列完全一致，4种pSEB．siMDRl质粒构建成功。各组转染后均可见绿色荧光表达，siMDRl．1，．2，．3和．4均能不同程度抑制MDRl基因表达，siMDRlPool组抑制效率最高，其中siMDRl．1，．2，．3和Pool组与对照组相比有统计学差异(P<0．05)，而siMDRl．4与对照相比无统计学差异(P>O．05)。P．糖蛋白表达与MDRl基因表达情况一致。抑制后，长春新碱使L2RYC细胞的增殖降低，siMDRlPool组最明显结论：

6、重组pSEB—siMDRl真核表达质粒构建成功，能有效抑制MDRl基因和蛋白的表达，siMDRlPool能最好地抑制MDRl的内源性表达，因此后续实验将选用siMDRlPool进行转染。重庆医科大学博士研究生学位论文第二部分超声联合微泡体外促pSEB．siMDRl质粒转染逆转肿瘤细胞耐药性第一节超声联合微泡体外细胞转染最适条件筛选目的：探讨超声联合微泡体外转染细胞的主要影响因素，筛选pSEB．siMDRl质粒转染L2RYC细胞的最适条件。方法：机械振荡法制备脂质微泡，然后用PLL吸附法将pSEB—HUS质粒分

7、层包裹在微泡外表面，制成载基因微泡。用不同强度的超声和不同超声暴露时间组合作为转染的条件，台盼蓝染色检验转染后细胞的存活率，流式细胞仪检测质粒的转染效率。结果：不同细胞转染的条件不同，随着超声强度和暴露时间增加，转染效率不断增高，超过一定限度后细胞死亡也明显增加而不能用于后续实验。当超声强度0．5W／cm2以及暴露时间为30s时，能保证90％以上细胞存活且转染效率26％。结论：适合的超声强度和暴露时间能够明显促进质粒转染细胞，并不会对细胞存活产生明显的影响。第二节超声联合微泡促pSEB—siMDRl转染降低细

8、胞对化疗药物耐药目的：研究超声联合载pSEB．siMDRl微泡的体外转染效率以及转染后对MDRl基因及P．糖蛋白表达和功能的抑制。方法：将pSEB—siMDRl质粒或制备的携带pSEB．siMDRl质粒的脂质微泡加入培养的细胞中，设置实验分组：①单纯质粒组(I组)②质粒+超声组(II组)③载基因微泡组(III组)④载基因微泡+超声6重庆医科大学博士研究生学位论文组(IV组)⑤空白对照组(V组)⑥脂质