探讨聚肌胞联合E7免疫对宫颈癌患者树突状细胞的影响.doc.doc

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1、文章来源毕业论文网www.biyelunwen.com.cn探讨聚肌胞联合E7免疫对宫颈癌患者树突状细胞的影响文章来源毕业论文网www.biyelunwen.com.cn1引言　　人乳头瘤病毒(HPV)感染是引起宫颈癌的主要病因，HPV相关抗原具有宫颈癌特异性，因此HPV相关抗原能够有效预防人的HPV感染，但是临床研究发现不能治疗HPV感染、宫颈癌或癌前病变。笔者首次报道，聚肌胞(poly(I:C))联合E7(44-62)（属HPV多肽，同时含MHCI和II类抗原）能产生特异性细胞毒性T细胞反应且增加树突状细胞（D

2、C）数量，完全抑制人宫颈癌模型小鼠的肿瘤生长，与MHCI类抗原比较，含MHCI和II类抗原的多肽疫苗能够显著延长抗肿瘤免疫反应时间[1-3]。拟通过MTT实验和流式细胞技术研究正常人、宫颈癌和癌前病变患者的外周血DC在聚肌胞联合E7(44-62)刺激下的免疫反应，为其临床应用提供理论和实验依据。　　2材料和方法　　2.1检测对象及分组　　（1）宫颈癌组：10例。为湖南省肿瘤医院收治的宫颈癌患者，女，年龄41～62（平均51.5）岁。所有宫颈癌均经病检证实，凡接受放、化疗或免疫调节治疗患者均排除在外。术前1周内清晨空

3、腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，待检。　　（2）CIN组：10例。均为宫颈上皮内瘤变Ⅱ/Ⅲ期患者，所有宫颈上皮内瘤变经病检证实。女，年龄39～54（平均46.2）岁。术前1周内清晨空腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，待检。　　（3）正常对照组：10例。女，年龄28～35岁（平均34.2）岁，均为在校的健康志愿学生，清晨空腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，待检。　　2.2检查项目及方法　　2.2.1DC的分离和培养　　方法见参照文献[4]，以Ficoll密度梯度离心方法从外周血中分离单个核细胞，在无菌条件下将所获细胞加入含10%小牛

4、血清的RPMI1640培养液（美国GBICO公司产品）中培养（37℃、5%CO2）。1h后，轻洗培养瓶去除非贴壁细胞，贴壁细胞加入含重组人白细胞介素-4(500U/mL)和重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子（500U/mL）的RPMI1640培养液中继续培养7d，2～3d更换培养液1次。　　2.2.2MTT实验　　加入0.25%Trypsin-EDTASolution消化后，用RPMI1640培养液制成DC文章来源毕业论文网www.biyelunwen.com.cn细胞悬液，台盼蓝拒染法鉴定细胞存活率>95%。各

5、组细胞（1×105/ml，总体积100μl）在RPMI1640完全培养液中与含聚肌胞（终浓度为50μg/mL，购自英国GEHealthcare公司），或聚肌胞（终浓度为50μg/mL）和E7(44-62)（终浓度为100μg/mL，序列为QAEPDRAHYNIVTFCCKCD，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）或培养液（空白对照）共同培养。5d后，加入MTT(10μl，5mg/ml)并于37℃孵育4h，采用酶标仪检测490nm波长吸光度值。DC细胞增殖比例＝实验组吸光

6、度/空白对照吸光度。　　2.2.3流式细胞技术　　将分离的DC移入RPMI1640培养液内含聚肌胞，或聚肌胞和E7(44-62)（终浓度均同前），或培养液共同培养16h。根据固定/渗透试剂盒（购自英国BD公司）说明进行细胞内双染色，流式细胞仪检测异硫氰酸（FITC）标记鼠抗人CD11c单克隆抗体和藻红蛋白（PE）标记鼠抗人CD86单克隆抗体（抗体均购自美国eBioscience公司）标记的细胞。阳性细胞百分率（%）＝染色阳性细胞数／总细胞数×100％。　　2.3统计分析　　计量资料用±S表

7、示，组间差异采用ANOVA及q检验分析。P<0.05认为统计学上有显著意义，统计学处理采用SPSS13.0软件。　　3结果　　3.1DC的比例及增殖反应　　宫颈癌组外周血的DC占外周血单核细胞的比例（0.12+0.007，%）显著低于C组（1.13+0.056，%）和CIN组（0.25+0.012，%）（均P<0.01）；CIN组DC的比例显著高于宫颈癌组（P<0.05）。与聚肌胞比较，聚肌胞联合E7(44-62)刺激能够显著提高C组、CIN组和宫颈癌患者外周血的DC的增殖反应（均P<0.0

8、1）。宫颈癌组和CIN组DC对聚肌胞联合E7(44-62)刺激的增殖反应显著低于C组（均P<0.01），宫颈癌组DC的增殖反应与CIN组无显著差异（P>0.05），图1。　　　　3.2DC的CD11c+/CD86+表达　　宫颈癌组DC的CD11c+/CD86+的表达水平显著低于C组和CIN组（P<0.01，P<0.05），C组CD11