探讨聚肌胞联合e7免疫对宫颈癌患者树突状细胞的

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1、探讨聚肌胞联合E7免疫对宫颈癌患者树突状细胞的1引言　　人乳头瘤病毒(HPV)感染是引起宫颈癌的主要病因，HPV相关抗原具有宫颈癌特异性，因此HPV相关抗原能够有效预防人的HPV感染，但是临床研究发现不能治疗HPV感染、宫颈癌或癌前病变。笔者首次报道，聚肌胞(poly(I:C))联合E7(44-62)（属HPV多肽，同时含MHCI和II类抗原）能产生特异性细胞毒性T细胞反应且增加树突状细胞（DC）数量，完全抑制人宫颈癌模型小鼠的肿瘤生长，与MHCI类抗原比较，含MHCI和II类抗原的多肽疫苗能够显著延长抗肿瘤免疫反应时间[1-3]。拟通过

2、MTT实验和流式细胞技术研究正常人、宫颈癌和癌前病变患者的外周血DC在聚肌胞联合E7(44-62)刺激下的免疫反应，为其临床应用提供理论和实验依据。　　2材料和方法　　2.1检测对象及分组　　（1）宫颈癌组：10例。为湖南省肿瘤医院收治的宫颈癌患者，女，年龄41～62（平均51.5）岁。所有宫颈癌均经病检证实，凡接受放、化疗或免疫调节治疗患者均排除在外。术前1周内清晨空腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，待检。　　（2）CIN组：10例。均为宫颈上皮内瘤变Ⅱ/Ⅲ期患者，所有宫颈上皮内瘤变经病检证实。女，年龄39～54（平均46.2）岁。术前1周内

3、清晨空腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，待检。　　（3）正常对照组：10例。女，年龄28～35岁（平均34.2）岁，均为在校的健康志愿学生，清晨空腹抽取外周静脉血，肝素抗凝，待检。　　2.2检查项目及方法　　2.2.1DC的分离和培养　　方法见参照文献[4]，以Ficoll密度梯度离心方法从外周血中分离单个核细胞，在无菌条件下将所获细胞加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液（美国GBICO公司产品）中培养（37℃、5%CO2）。1h后，轻洗培养瓶去除非贴壁细胞，贴壁细胞加入含重组人白细胞介素-4(500U/mL)和重组人粒-巨噬细胞集落刺

4、激因子（500U/mL）的RPMI1640培养液中继续培养7d，2～3d更换培养液1次。CD11c+/CD86+的表达；G：宫颈癌组DC在加入培养液后CD11c+/CD86+的表达；H：宫颈癌组DC在加入聚肌胞后CD11c+/CD86+的表达；I：宫颈癌组DC在加入聚肌胞联合E7(44-62)后CD11c+/CD86+的表达。宫颈癌组DC的CD11c+/CD86+的表达水平显著低于C组和CIN组（P<0.01，P<0.05），C组CD11c+/CD86+的表达水平显著高于CIN组（P<0.05）。与聚肌胞组比较，聚肌胞联

5、合E7(44-62)刺激能够显著提高宫颈癌患者外周血的DC的CD11c+/CD86+表达水平(P值分别<0.01，<0.05)。　　4讨论　　E7基因是引起宫颈上皮细胞恶变最重要的癌基因之一，所编码的E7蛋白是宫颈癌特异性抗原。因此，E7蛋白适于作为宫颈癌疫苗的抗原物质[5]，但单独免疫后往往无法产生有效的抗宫颈癌免疫应答，其较弱的免疫原性及主要组织相容性抗原（MHC）限制性（即必须与MHC类分子结合后才能被具有相同MHC表型的免疫细胞所识别）是抑瘤失败的主要原因[6,7]。　　聚肌胞是一种人工合成的双链RNA，和于病毒感染的

6、双链RNA具有类似的抗病毒和抗肿瘤功能。聚肌胞是Toll样受体3的配体，Toll样受体3在人和动物髓样DC、T细胞、纤维原细胞内同时表达，聚肌胞与Toll样受体3结合能够诱导大量的IFN-α和IFN-β[8]，后者具有广谱抗病毒作用。聚肌胞增强CD8+T细胞的功能，而且通过抑制凋亡延长CD8+T细胞的存活；还能够增加活化CD4+T细胞的存活率；源自黑色素瘤特异性抗原的MHCⅠ类多肽和聚肌胞联合免疫小鼠后，能够明显增加抗原特异性CD8+T细胞的数量和IFN-γ、TNF-a的释放，并且还抑制黑色素瘤细胞的生长

7、[9,10]。聚肌胞能够增强免疫反应性、促进具有MHCI、II类表型T细胞的存活/功能以及促进DC成熟和增加抗原呈递能力的特性[11]。　　笔者[1]研究含有全部抗原决定簇的肿瘤细胞裂解体联合poly(I:C)免疫的抑瘤作用，采用联合注射poly(I:C)和TC-1细胞裂解体（TC-1细胞是转染E6、E7基因和活化H-ras基因的C57BL/6小鼠肺上皮细胞）的方法，能够明显延缓人宫颈癌模型小鼠的肿瘤生长；另一种方案先将poly(I:C)转染TC-1细胞，裂解已转染的TC-1细胞后注射入人宫颈癌模型小鼠皮下，结果发现比联合注射poly(I

8、:C)和TC-1细胞裂解体有更强的CD8+细胞毒性T淋巴细胞反应和抗肿瘤作用。笔者[2]证实人宫颈癌模型小鼠DC较正常小鼠数量明显减少和功能缺陷，而E7（49-57）和poly(I:C)的联合