桔小实蝇抗热胁迫反应的机制研究

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1、西南大学博士学位论文桔小实蝇抗热胁迫反应的机制研究姓名：夹福先申请学位级别：博士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：王进军20120602中文摘要置量量曼量昌量量量量量詈昌量詈詈鲁詈量量詈詈量量量詈詈量量量量量量量量量鲁量量皇■量曹量量量喜量量量量量量量量昌詈量皇鼍詈詈昌皇篁薯昌詈詈量曼桔小实蝇B口c抛ce7位如坶a胁隶属于双翅目Diptera，实蝇科蛐tidae，是一种重要的世界性害虫。该虫可为害46个科的250多种水果和蔬菜，并造成严重的经济损失。桔小实蝇具有很强的扩散性和环境适应性，能进行远距离扩散并迅速占领入侵地。该虫原产于热带和亚热带地区，现己成为

2、中国南部、东南亚、印度次大陆和夏威夷群岛危险性果蔬害虫，这些地区的夏季高温往往高于400c；随着全球气候变暖，桔小实蝇逐渐向高纬度地区扩散，在中国湖北、江苏等冬季温度低于00C的地区也可完成越冬。桔小实蝇适宜发育的温度范围在15～340C之间，因此，夏季高温和冬季低温等极端温度必将对桔小实蝇造成热胁迫。在长期的进化过程中，桔小实蝇形成了一系列反应机制来应对热胁迫。热激蛋白是细胞或生物体在受热或其他因素刺激后，所产生的一类在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白，与生物体的热耐受性和抗逆性有重要的关系。热胁迫带来的氧化压力使生物体内产生过氧化反应

3、，而抗氧化系统则可以清除氧自由基，缓解氧化压力，修复胁迫损伤等。以双向电泳和质谱鉴定技术为核心的蛋白质组学的发展为分离鉴定昆虫体内的蛋白质创造了有利条件。差异蛋白质组学的兴起，更是为分离已知的热胁迫应激蛋白，以及去寻找那在抗热胁迫响应过程中起作用的未知蛋白提供了有利工具。本学位论文以桔小实蝇为研究对象，在全球气候变暖的大环境下，瞄准生物适应热胁迫这一国际研究热点，利用差异蛋白质组学方法分离并鉴定了热胁迫下桔小实蝇的响应蛋白；采用微量滴定酶标板法测定了其体内抗氧化酶活性的变化；利用ImPCR、RACE及卯CR等技术克隆并解析了桔小实蝇热激蛋白基因和抗氧化酶基

4、因及其转录表达模式，从不同角度阐明了桔小实蝇对热胁迫的响应机制。经过近3年的研究，获得以下主要结果：1．桔小实蝇在热胁迫下的抗氧化反应丙二醛(加A)是多元未饱和脂肪酸过氧化反应的主要氧化产物，可以通过测定其含量来明确脂质过氧化的水平(LPO)，因此№A己被作为氧化胁迫的一个生物标识。高温和低温胁迫下桔小实蝇体内的MDA含量都较对照270C显著升高，说明热胁迫打破了桔小实蝇体内氧化还原反应的平衡，诱导了体内抗氧化酶活性增强。桔小实蝇遭受热胁迫后，其体内超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著升高，催化体内因氧化胁迫而产生的高浓度超氧阴离子(02。。)发生歧化反应生

5、成过氧化氢(H202)。随着温度极端升高和降低，SOD活性升高，同时随着胁迫时间延长而呈现先上升后下降的趋势。过氧化氢酶(CAr)活性较270C显著增强，西南大学博士学位论文暑詈曼曼量舅鼍詈曼曼量昌曹寡量曼量曼詈曼曼量量詈詈篁舅皇!!曼曼曼鼍暑詈置皇皇皇曼曼量罾舅罾舅篡量罾曹曼曼曼曼量邑量曼曼皇曼曼曼昌皇量曼曼皇曼曼分解过量的H202，生成对机体无害的H20和02，以降低体内活性氧(ROS)的含量而缓解氧化压力；随着温度极端升高和降低，CAT活性升高，同时随着胁迫时间的延长，CAT活性也呈现上升后又下降的变化趋势。谷胱甘肽S．转移酶(GST)的活性也发生了

6、显著的变化，高温胁迫下显著升高，低温胁迫下随着胁迫时间的延长，GST活性下降后又快速上升并高于对照270C下的活性；GST活性升高，分解过多的脂类过氧化物，在桔小实蝇抗热胁迫导致的氧化胁迫反应中发挥了重要作用。过氧化物酶(POD)和总抗氧化能力(T-AOC)以较高的活性值稳定地发挥着抗氧化胁迫的作用。2．桔小实蝇在热胁迫下的差异蛋白质组学研究双向电泳是一种对生物体内复杂蛋白质体系进行高效分离的技术，分辨率高、重复性好和稳定性强是其最基本的特征。蛋白质样品的质量直接影响双向电泳的分离效果和生物信息的完整性。本研究选择桔小实蝇体内的总蛋白进行分析，建立了一套稳

7、定、重复性好的双向电泳技术体系，全面挖掘桔小实蝇响应抗热胁迫反应的功能蛋白：通过在常规裂解液中引入2M硫脲提高了蛋白质特别是疏水蛋白的溶解性；继而利用蛋白质纯化试剂盒纯化获得了高质量的蛋白质样品；在胶条平衡缓冲液中增加了甘油和SDS的含量提高了平衡效果；PAGE凝胶经质谱兼容的银染方法染色，最终获得了高分辨率的双向电泳图谱。上述双向电泳技术体系的建立为分离和鉴定桔小实蝇抗热胁迫响应蛋白质奠定了坚实基础。利用蛋白质组学技术对桔小实蝇抗热胁迫的响应机制进行了研究。将试虫在400C高温和OoC低温下胁迫3h后，提取总蛋白质，使用1，H3～10、17cm的胶条和1

8、0％SDS．PAGE凝胶进行双向电泳。经PDouestV8．0．1