环介导等温扩增技术在下呼吸道感染病原菌诊断上的应用

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1、引言感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。该方法利用一套特异性引物(4条)，以识别靶基因的6个特定区域。反应在等温条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在-d,时内完成；扩增产生的产物量大，肉眼、电泳或比浊仪均可判度结果；灵敏度高、特异性强，解决了核酸诊断上出现的诸多难题，使其作为快速诊断成为可能。故本法一经面世，即受到多国学者的关注。LAMP法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，4条引物中2条为内引物，2条为外引物，一般以200—300bp为宜。内引物FIP(forwardinnerprimer)包含Flc序列和F2(F2c区域的互补序列)，即5’一

2、F1rF2；内引物BIP(backwardinnerprimer)包含Blc(B1区域的互补序列)和B2序列，即5’Ble--B2。外引物为F3和B3序列。如图1所示：靼3．墓蛊＆!竺出卤占s．_曩爵Ⅵ露H哥}———一'曼卜暑雷F案}■一曙漆BIP图1靶序列上6个特异区域及引物设计LAMP反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段啼1。利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件(65"C左右)保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应，扩增出LAMP特征性梯状条带。还可通过设计两条环引物(FL、BL)可使反应速度提升1／2-

3、1／3嘲环介导等温扩增结果判定主要方法有：(1)电泳。将扩增产物电泳后在紫外灯下观察可见扩增产物呈梯状条带：(2)直接观察扩增管的浊度。研究发现LAMP阳性扩增管反应后形成副产品焦磷酸镁，而没有发生扩增反应的阴性管中没有副产品焦磷酸镁产生，因此阳性管的浊度比阴性管高，经高速离心后出现更为明显的白色沉淀，阴性对照管则没有白色沉淀留1；(3)加入染料直接用肉眼判定结果。可用结合双链DNA的荧光染料SYBRGreenl染色，在紫外灯或同光下通过肉眼进行判定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBRGreenI的橙色不变m1。随着LAMP方法的不断发展，目前电泳

4、法已经很少应用。LAMP反应体系的构成和PCR的相似，包含了引物、模板DNA、BstDNA聚合酶、dNTP和缓冲液。其操作程序简便，具体步骤是：首先将模板、引物、2引言dNTP和缓冲液按比例配制，混匀后置95℃中5分钟(参与反应的模板仍然是未变性的DNA)；然后冰浴5一10分钟退火；而后加入适量的BstDNA聚合酶，于60℃一65℃反应llJ,时。移至80℃热浴10分钟灭活BstDNA聚合酶。与传统的PCR扩增核酸相比，LAMP的优点有：(1)特异性强；4条引物对靶序列的6个特异序列区的识别。(2)等温高效；LAMP在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的损失，在

5、1／b时内可将靶序列扩增至109-1010倍。而且受非靶序列的影响小，模板也不需要加热变性吲。(3)敏感性高；其检测限更低，仅为6个拷贝【51，大大高于传统PCR方法。(4)操作简便；产物易检测，不需繁琐的电泳，肉眼即可判断。正是由于其有诸多优点，自LAMP技术建立8年以来的时间内，该技术已经广泛应用于对病毒，细菌，寄生虫以及环境中细菌等病原体的检测研究，取得了可喜的成就。本课题为北京大学人民医院协作的国家863课题。根据LAMP技术的基本原理，并结合临床实验室的具体要求，初步确定的下呼吸道常见的11种病原菌：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、铜

6、绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体；以病原菌的基因保守区为检测对象，设计出能扩增所研究病原菌的LAMP引物；提取各病原菌DNA后，加入EvaGreen荧光染料和反应液及引物行LAMP扩增，置于Real．TunePCR仪中65℃反应，定时(1～2分钟检测一次)荧光检测，绘制溶解曲线，进行结果分析。本课题下一步的研究计划是设计含LAMP技术的基因芯片检测下呼吸道感染，省去大量人工操作，使其能准确、简便、实用地应用于临床。3材料与方法第2章材料与方法2．1主要实验仪器和器材RT-CyclerTM236实时荧光定量PC

7、R仪(博奥生物有限公司)CapitalBioMixe一24恒温振荡器(博奥生物有限公司)DNA提取仪(4800型，美国PERKIN公司)SW—a—TA水平超净工作台(苏州净化设备总厂)VITEK2．compact全自动细菌分析仪(法国生物梅里埃公司)vrrEK2革兰氏阳、阴性细菌鉴定卡血平板(由英国oxoid公司提供原料)巧克力平板(由英国oxoid公司提供原料)中国蓝平板(杭州微生物试剂有限公司产品)隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)念珠菌显色平板光学显微镜紫外线投射仪超纯水净化系统超低温冰箱低温离心机2．2主要试剂BstDNA聚合酶、UN