尿路致病性大肠埃希菌持留相关机制的研究

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1、复旦大学博士论文尿路致病性大肠埃希菌持留相关机制的研究中文摘要细菌感染治疗领域，目前面临以下两大问题。一方面，全球抗菌药物使用负荷不断增大，不合理应用甚至滥用抗菌药物现象突出，日益严峻的细菌耐药性问题成为全球关注的焦点。细菌耐药性往往由于存在某些耐药基因或固有基因发生突变而引起，细菌不仅可将耐药性遗传给子代细菌，而且可通过基因水平转移而造成耐药性的广泛播散。耐药细菌引起的感染已构成抗感染治疗的新挑战，人们正逐渐陷入“无药可用”的窘境。另一方面，临床细菌感染治疗过程中发现，某些病原菌，体外药敏试验显示对抗菌药敏感，但在体内可耐受药物的抗菌作用，并可躲避宿主的免疫

2、防御体系，在宿主体内长期存在，难以被彻底清除，成为持续感染、慢性感染或反复发作性感染的“原凶”，比如结核病，葡萄球菌菌血症，尿路致病性大肠埃希菌(UropathogenicEscherichiacoli，UPEC)引起的反复发作性尿路感染等，这一问题又带来“有药无效”的困惑。对抗菌药物敏感的细菌难以被清除的这一特性称之为持留(persistence)。广义而言，与细菌粘附相关的致病因子、生物膜的形成以及形成持留菌(persister)等因素，使得细菌难以被清除，均称为“持留”。狭义的“持留”则是特指持留菌能耐受高浓度抗菌药物以及各种环境应激因素而存活的能力。基

3、因型完全相同的菌群中的很少一部分细菌亚群能耐受大剂量抗菌药物作用而存活下来，而在脱离抗菌药物的环境后又可繁殖，这一细菌亚群的子代仍保持对该抗菌药物的敏感性，这些存活下来的细菌称之为持留菌。本文题目中的“持留”取其广义含义，主要包括与粘附因子相关以及与phoU基因相关的持留。尿路感染(Urinarytractinfection，UTI)是最常见的感染性疾病之一，女性发病率远高于男性。据统计，60％女性一生至少发生一次尿路感染，而25％急性膀胱炎的患者可反复发作。大肠埃希菌是尿路感染最常见的病原菌，70．95％的社区获得性尿路感染和约50％的医院获得性尿路感染都由

4、UPEC引起。在众多致病因子中，粘附因子被认为与UPEC难以被清除有关。UPEC的粘附因子种类繁多，主要包括1型菌毛、P型菌毛、S／F1C菌毛、Afa／Dr粘附因子家族，以及某些与生物膜形成相关的粘附因子等。其中Afa／Dr粘附因子Afa可通过与泌尿道上皮细胞表面特异性受体的相互作用，介导细菌进入宿主细胞内，躲避宿主对细菌的清除和部分抗菌药物的杀菌作用；而进入胞内的细菌可大量繁殖，随着泌尿道上皮更新脱落，胞内大量细菌释放，从而引起尿路感染再次发作，故认为携带a疡基因的UPEC容易引起尿路感染的反复发作。而粘附因子PapG，由于其受体主要分布于肾脏，有研究认为其

5、主要与急性肾盂肾炎关系密切。．∥“基因编码的1复旦大学博士论文粘附因子A943主要参与生物膜的形成，从而亦可使菌体难以被清除。除了粘附因子外，UPEC持留菌的形成，亦是病原菌难以被清除的一个重要方面。关于细菌形成持留的机制，至今尚不明确，目前普遍认为是与持留菌低代谢状态有关。2007年有研究在大肠埃希菌W3110菌株中发现了与持留相关的新基因—础Du，插入突变使该基因失活后，突变株能量代谢相关基因的表达上调，细菌处于高代谢状态，而对许多抗菌药物以及各种应激状态的持留能力明显下降，突变恢复后，菌株持留能力得以恢复。本课题组比对已公布的UPEC菌株phoU基因序列

6、与野生株W3110phoU基因序列发现：W3110phoU第236位氨基酸为甘氨酸G，而UPEC菌株，包括UTll89与CFT073、536等的phoU第236位突变为谷氨酸E。本课题第三部分探讨该氨基酸位点的突变对UPEC持留能力的影响。基于上述研究背景，本课题收集华山医院2008年1月至2009年12月尿路感染住院患者分离培养的UPEC47株，以及从健康志愿者肛拭子标本培养分离大肠埃希菌26株，进行菌株耐药性、同源性分析、粘附因子基因以及phoU基因相关持留机制的研究，探索临床尿路感染反复发作，UPEC菌株难以清除的机制；为开发新型尿路感染治疗药物提供理论

7、基础。本研究内容包括以下三部分。第一部分UPEC临床株与肠道定植大肠埃希菌药物敏感性试验与同源性分析我们收集了2008年1月至2009年12月住院尿路感染患者尿液标本中分离的47株UPEC，并从健康志愿者肛拭子标本分离培养26株肠道定植大肠埃希菌作为对照。用琼脂稀释法测定哌拉西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、哌拉西林／他唑巴坦、头孢哌酮／舒巴坦、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星和呋喃妥因等15种抗菌药物对两组菌株的最低抑菌浓度(MinimalInhibitortyConcentration，MIC)。根据2010年版CL

8、SI(ClinicalandLabor