尿路致病性大肠埃希菌外膜蛋白t致病相关功能的研究论文

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1、＼㈣蝶硕士学位论文尿路致病l生大肠埃希菌外膜蛋白T致病相关的功能研究硕士研究生：赵铁指导教师：曹虹教授摘要一、背景细菌、病毒、真菌和寄生虫病原体以及这些病原体的代谢产物所引起的感染性疾病，迄今仍然是人类死亡和伤残的主要原因之一，每年全球引起1700万以上的新发病例I¨。尿路感染(Urinarytractinfection，UTIs)是临床感染中第二位的感染【2l。女性因生理原因，较男性易感。大约有81％的UTIs发生在女性，年龄在16到35岁之间，30岁的妇女中有1／3．1／4都有过急性尿路感染的病史，并且复发率高。其次，UTIs也是免疫力低下人群常见的感染性疾病

2、。尿路感染按解剖部位不同分为尿道下部感染和上行性感染，前者包括尿道炎和膀胱炎，后者指肾盂肾炎【3】。肾盂肾炎是尿路感染最严重的形式，当病史超过半年至一年就有转成慢性肾盂肾炎的可能性，而慢性肾盂肾炎久治不愈是肾功能衰竭较常见的原因之一。尿路致病性大肠埃希菌(UropathogenicEscherichiacoli，UPEC)引起的UTIs占80％．90％【4l。大部分尿路致病菌都起源丁肠道，并经尿道上行至膀胱，约95％的UTIs的起始感染部位是膀胱14,5l。目前主要的研究重点是围绕UPEC与宿主之间的关系展开的。UPEC与其它致病性大肠埃希菌一样，染色体上具有毒力

3、因子信息。UPEC相关毒力因子包括：Gt．溶血素、细胞坏死因子、转铁蛋白等；一方面，细菌通过这些毒力因子在宿主中达到存活繁殖的目的；另一方面宿主摘要利用机体免疫系统，防御来自细菌的攻击，发生炎症反应；在不断的相互作用过程中，细菌产生一些酶抵抗来自宿主的防御系统。比如，本次实验中发现UPEC毒力因子ompT可水解人固有免疫成分人防御素，从而为细菌在宿主体内存活提供条件。在尿路感染中，细胞因子是宿主免疫细胞产生的一大类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。本文以尿路感染动物模型为基础，扩展思路，测定宿主不同组织细胞因子的表达水平，为进一步深入

4、尿路感染的机制提供依据。UPEC对宿主尿路上皮细胞的粘附能力是其致病的最重要因素，荚膜、脂多糖等一些粘附器官及粘附素的表达常常是致病的关键，其有助于UPEC结合于尿路进而避免被尿液冲刷清刚61。本次试验研究表明：ompT基因的敲除，可能导致R聊日基因表达的下调；FimH是一种已经验证的粘附素【7】，并且前期体内及体外结果也表明，ompT基因的敲除可使UPEC粘附率下降，与前期实验结果一致。UPEC毒力因子的存在和毒力的大小决定了所致疾病的种类和严重程度；以相同方法，比较ompT对其他毒力基因的调控，也在本文中做了初步探讨。这些毒力基因功能多与粘附、侵袭、血清抗性和

5、代谢等相关，并在实验过程中证实。关于ompT调控这些毒力因子的相关机制还未得到实验证樊引。本研究利用前期RED同源重组系统构建的尿路致病性大肠杆菌CFT073的ompT基因敲除株(CFT073AompT)，并将ompT基因连接至低拷贝质粒pUCT中构建回补株(ompT／pUCT)，考察ompT基因的缺失对致病株抵抗人防御素的影响。并通过参考文献及蛋白功能预测得到，ompT通过调控某些毒力蛋白前体成分的表达而在尿路感染中起作用；并且通过荧光定量PCR验证ompT基因对主要毒力蛋白表达的影响。本课题的目的在于初步研究基因ompT在尿路致病性大肠杆菌的致病机理中所起到的

6、作用。硕士学位论文二、研究方法1、人防御素HBD．4克隆、表达以及鉴定为进一步研究OmpT在尿路感染致病机理中所起的作用，克隆表达人p类防御素HBD．4模拟体外感染环境。本实验以膀胱癌细胞总RNA为模板，PCR扩增HBD-4基因，连接至pET-28a，构建表达载体pET28a．HBD．4。将重组质粒转化入BL21(DE3)，经IPTG诱导后HBD．4表达。纯化后恢复蛋白活性。通过SDS—PAGE检测。2、人防御素HBD．4抑菌活性检测将对数生长期的大肠埃希菌CFT073、CFT073AompT和ompT／pUCT(CFU：I×106)4001接种于的LB培养基中，

7、再加入lOpl防御素蛋白HBD-4孵育，使每管HBD一4蛋白的终浓度为200pg／ml。将培养物37"C孵育8h，间隔一小时在600nm处测定各管的吸光度。将各管稀释106倍后均匀涂布于LB固体培养基上，37℃孵育过夜后菌落计数。每种细菌均做副管。3、尿路感染动物模型的建立经尿路分别灌注CFT073及CFT073AompT，建立尿路感染小鼠动物模型，继续饲喂12h，观察小鼠活动情况。12h后处死小鼠，腹部消毒，取出膀胱；用PBS清洗5～lO次；加入lmlPBS后匀浆，匀浆液作1：1000、l：10000、l：100000梯度稀释。取出lOpl稀释液均匀涂布于LB平

8、板，12h