草莓伪温和黄边病毒提纯技术的研究

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1、维普资讯http://www.cqvip.com7r簟6卷第4船中国囊●拳Vo1．6N0．41991年l明VIROLOGICASINICADee．1991草莓伪温和黄边病毒提纯技术的研究吴元华韦石泉一一——，————一———P(沈阳在业大学，沈阳llG161)2．}提要纯化的草莓伪温和黄边病毒(SPMYEV)，小叶嫁接繁殖于指示植物草莓UC-4上．然后采样榨汁，结合豪乙=醇(PZO)沉淀．蔗糖垫底差速离心及连续蔗糖密度梯度离心．能成功地将草莓伪温和黄边病毒提纯出来。经电镜观察为丝杆状病毒粒俸．长×宽为650am×l2—13am。提纯的病毒制剂．经紫外分光光度计测定．呈典型的核蛋白吸收曲线，其

2、最大值位于263nm，最小值位于243nmA260／A280—1．24，用冰醋酸分解病毒，提取表壳蛋白，经SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量约37000道尔顿。关键调：草莓伪温和黄边病毒提纯程序衣壳蛋白草莓伪温和黄边病毒(Strawberrypseudo—mildyellowedg~virus，SPMYEV)国内外研究较少，据知它可能属于荷兰香石竹潜隐病毒组(Carlavirusgroup)的一新成员l。目前尚未找到其它适宜的繁殖寄主，敞病毒仍须繁殖于草莓株上。由于提纯病毒所用的感染病毒的草莓叶，在其榨汁中含很多的多元酚及单宁等物质，这些物质在榨汁过程中，易引起该病毒在生体外的集聚或钝化

3、”。此外，本病毒在草莓组织中含量很低，因此，从草莓中直接提纯SPMYEV显然相当困难。我们经过多次试验，摸索到一种较好方案，能够较满意地从染病草莓中提纯这种SPMYEV。材料和方法一、供试寮毒将从春香品种上分离纯化的SPMYEV(本棱植保系植物病毒研究室保存)，以小叶嫁接接种法繁殖于指示植物草莓UC一4上，采收病叶及叶柄，用作提纯试验的材料二、寮毒撮纯设计了几种提纯程序，包括不同抽提缓冲液，不同有机溶剂及豪乙二醇沉淀、蔗糖垫底差速离心及连续性蔗糖密度梯度离心等试验。三、电键观察提纯的SPMYEV样品置于载网，经2和磷钨酸pH7．0负染5分钟，自然干燥后进行电镜观察(JEM一100cx)。四、

4、SPMYEV衣壳蛋白质的分鼻疑分子■一定表壳蛋白质分离参照Fraenkel—conralI

5、的冰醋酸法操作。采用SDS-豪丙烯酰胺电泳法恻其分子量(凝腔浓度为10嘶，内含0．1和SDS)电}jc板以考本文于1901年3月l1日收到．4月4日修回。维普资讯http://www.cqvip.com中国病毒学第0卷马斯亮兰染色，甲醇一冰醋酸脱色，标准蛋白质样品，选用了枉糖桉酸酶(ribonuelease，MW37000)，胰凝乳蛋白酶元A(chymotrypsln，MW25000)，卵清蛋白(albumin，MW43000)及牛血请白蛋白(bovineserumalbumin，MW67000)。结

6、果一、抽提缓冲液的选择及其效果各取冷冻UC一4病叶140g，分别加入5倍体积的有关缓冲液匀浆，双层纱布过滤后得粗提液经6000rpm离5*20分钟。上清液电镜观察，调查病毒粒子控出频率，结果表明，0．1mol／L硼酸缓冲液pH8．2抽提病毒最好。在电镜下放大4万倍，50个视野中有病毒粒子42个，0．5mol／L、PB、pH7．5次之，宿毒粒子27个；0．1mol／L柠檬酸盐缓冲液pH7．O较次，病毒粒子为l2个；0．05mol／L碳酸盐缓液pH9．6，及0．02mol／LTris—HCI缓冲液pH7．5，均未见到病毒粒子。草莓叶中富含单宁及多种酚类物质，因此，为防止病毒纯化，抽提缓冲液中加入

7、尼古丁，巯基乙醇及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。试验证实，0．1mol／L硼酸缓冲液pH8．2或0．5mol／LPBpH7．5中，加入2％尼古丁、0．2巯基乙醇、2PVP及0．0lmol／LEDTA效果最好。二、不同有机溶剂澄清病毒效果的观察取上述粗提液分别加入氯仿等有机溶剂，振动l5分钟后，5000r／m离心l5分钟。取上清，比较澄清效果。结果表明25氯仿+8正丁醇有较好的澄清作用，溶液呈棕色，但从最终提纯病毒含量看，此步澄清仍能；f起病毒大量损失，故不宜采用。三、PEG沉淀和不同悬浮缓冲液在提纯中的作用取未经有机溶剂澄清的粗提液，分别加入6％聚乙二醇(PEG，MW6000)和0．imol／

8、LNaCI或6PEG，0．1mol／L及1TrionX一100，冰浴下搅拌至完全溶解，置4℃过夜，10000r／m离心30分钟，此沉淀分别用不同缓『畸】液悬浮，再于10000r／m离5,2o分钟，上清经电镜观察j结果表明J加TritonX一100的，沉淀呈乳白色，病毒悬液杂质较少，而不加TritonX一100的。沉淀呈乳白色，病毒悬液不净。电镜观察发现，加TritonX-100者，病毒粒子分散性好，且收量较多