病毒和病毒成份的提纯.doc

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1、第十四章病毒和病毒成份的提纯一、病毒的提纯(一)沉淀法(二)层析法(三)两相溶剂间分配系数法(四)红细胞吸附法(五)电泳法(六)超速离心法(七)超滤法二、病毒蛋白亚单位的分离三、病毒脂质的抽提四、病毒糖类的抽提一、病毒的提纯所谓病毒提纯,就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质——DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以

2、下几点可以作为判定标准。1.物理均一性测定病毒样品的物理均一性,是证明其纯度的常用方法,包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。2.病毒滴度与蛋白含量的比例测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高,说明病毒的纯度越高。113.免疫学反应免疫反应单一而无非特异反应，则说明病毒材料比较纯净。4.结晶形成病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。病毒提纯的主要依据和条件有:(1)病

3、毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖,要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒,病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯；而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2000～6000r/min离心30～40分钟，可除去90

4、％以上的细胞碎片和杂质。(2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。(3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子,可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法也不尽一致。(一)沉淀法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。1.中性盐沉淀法病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。2.聚乙二醇沉

5、淀法聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，11用于病毒沉的主要是分子量为2000～6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于毒悬液中,使其达到所需浓度,通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年)成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。3.有机溶剂沉淀法甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。4.等电点沉淀法病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而

6、发生沉淀。多数病毒的等电点在pH4.5～5.5之间，因此在pH3～6范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。5.皂土法Girin(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH4～4.5)吸附轮状病毒SA-11，再在碱性条件下（pH8.5），又使其洗脱下来,从而达到纯化目的。6.鱼精蛋白沉淀法鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共同沉淀

7、而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/LNaCl时,病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。(二)层析法病毒粒子表面携带特定的电荷群，因此病毒对离子交换树脂及类似的其它吸附剂具有亲和性。利用吸附剂的层析法分为两种，一种是正吸附法，即依据病毒粒子表面所携带的电荷进行特异性吸附，然后用适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收；另一种是负吸附法，即只吸附组织或宿主细胞成份等非病毒蛋白，而让病毒粒子通过。收集滤液后经差速离心沉淀法回收病毒。

8、由于各种病毒的大小和表面结构等理化性质不同，因此对吸附剂的亲和性也