生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法.doc

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1、生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法(一)制备工艺流程（1）脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺                            

2、                    

3、猴  肾  细  胞  培  养                            

4、←接种病毒（测0%正常细胞对照）                            

5、收获病毒，合并，加MgCl2→    

6、                            

7、无菌试验→                   

8、←猴病毒检查（获肾细胞）（SV40）             

9、               

10、B病毒检查（兔肾细胞）→      

11、←病毒效价滴定                            

12、                            

13、←合并，过滤加MgCl2                            

14、                            

15、                 ←无菌试验                            

16、分亚批→                     

17、←柯萨奇病毒检查（乳鼠）                            

18、

19、病毒滴定→                   

20、←型特异性检查                            

21、B病毒复检（家兔）→          

22、←T特征试验                            

23、分装病毒滴定→              

24、←猴体残余致麻痹力试验                            

25、（安全试验）病理切片         

26、结核杆菌检查→              

27、                            

28、分装→                       

29、←无菌试验    

30、                        

31、病毒滴定→                   

32、       →                    保存于-20℃待检定合格后                     加  工  糖  丸2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制备工艺         地鼠肾              剪碎，胰酶消化   地鼠肾细胞悬液    37℃,3天  细胞培养液，pH7.0～pH7.2         单层细胞              洗涤细胞，去除牛血清              10-4～10-5浓度病毒感染细胞       

33、       32～34℃培养2～3天    收获病毒液（收二次）              按1:2000加入甲醛              22℃，8天       灭活病毒液             合并，安全及效力试验          原液              加入亚硫酸氨钠         半成品             分装          成品             检定(包括理化性质，无菌试验、安全试验，             防腐剂、试剂及残余牛血清含量等）         合格成品(二)生产方法：病毒和病毒疫苗的生产方法基本相同，其规

34、模取决于细胞生产规模，因此上述介绍的细胞大量生产的方法和工艺均可用来生产病毒和病毒疫苗，可根据需要及适宜生产条件来选用培养装置，如转瓶培养，因设备简单，便于生产单位采用。而多层培养，微载体培养，目前国外已用于生产，我国仍在研究中。悬浮搅拌培养的简易装置已应用于疫苗生产，全自动悬浮发酵罐，在干扰素生产中有应用，但在疫苗生产中正在试用，下面着重介绍微载体培养法生产病毒的技术。1、微载体悬浮培养细胞的病毒生产工艺作者选VSV病毒来接种经微载体培养的敏感细胞，病毒的效价测定用A549细胞（也可用Wish或Hep-2细胞或鸡胚纤维母细胞测TCID50），病毒的效价为6LogTC

35、ID50/mL，用鸡胚细胞空斑法测定一般为107Pfu/mL。①VSV在方瓶贴壁细胞中的增殖（100mL方瓶，10mL培养基）待BHK21、BHK13、CHO-K1细胞长满单层，弃上清加入10-2VSV病毒悬液0.2ml，37℃吸附1小时，加病毒维持液培养20小时，于-30℃冻存，待测效价。②VSV在微载体悬液培养的细胞中增殖。微载体培养的BHK21或BHK13、或CHO-K1细胞，3～4天后细胞密度已达1×106细胞/mL静置30分钟尽量吸去原培养基37℃将10-2VSV病毒按50mL培养体积加入1mL病毒液于微载体细胞中37℃50r/min搅拌5