产肠毒素性大肠杆菌etpa及lt b共表达载体构建及免疫原性地分析

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2、兰垦盎些盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：务蠢暂k导师签名：签字日期：’】啦年；月y日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：弧牺＼毯签字日期：扣，节年占月≯日电话：邮编：万方数据摘要产肠毒素性大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)．是引起仔猪腹泻的主要病原之一。该菌的致病性与其毒力因子密切相关。EtpA为新发现的由ETEC分泌的胞外蛋白，类似粘附素，介导菌毛与宿主细胞的粘

3、附，具有一定的免疫原性。热敏肠毒素LTB是ETEC致腹泻的免疫活性中心，具有免疫佐剂活性。ETEC具有多种血清型，现有疫苗不能有效防控ETEC。基于此，本研究拟构建EtpA与LTB表达载体，制备疫苗，分析疫苗对小鼠的免疫效果，探索ETECDNA疫苗免疫的可行性，从而为ETEC免疫防控提供依据。根据NCBI公布的产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenicE．coli，ETEC)的不耐热肠毒素B亚单位抗原和菌毛蛋白Etpg的核苷酸序列进行特异性引物的设计，通过PCR扩增得到EtpA和LTB基因。胶回收纯化后将EtpA和LTB基因分别连接于克隆载体p

4、EASY-Blunt上，并转化到感受态DH5a细胞中，然后筛选阳性菌落进行酶切鉴定和测序，结果证明连接产物中分别含有EtpA和LTB，并分别命名为pEA—EtpA和pEA．L，TB。将鉴定结果正确的重组质粒与原核表达载体pET32a及真核表达载体pcDNA3．1用BamHI和勋D，分别酶切，目的基因通过T4DNA连接酶将到真核和原核表达载体中，并通过菌落PCR和质粒酶切进行鉴定，成功构建了原核表达载体pET-EtpA与pET-LTB及真核表达载体pcDNA．EtpA与pcDNA．LTB。将重组质粒pET-EtpA与pET-LTB分别转化入感受态BL21

5、(DE3)细胞中，在一定浓度的IPTG诱导进行蛋白表达，最后通过SDS—PAGE、WeStern．Blot检测鉴定了所表达的蛋白。按照常规方法，分别制备了含有EtpA与LTB质粒或蛋白的核酸疫苗与蛋白疫苗。将制各的EtpA蛋白疫苗、Etp～LTB蛋白疫苗和pcDNA—EtpADNA疫苗、pcDNA-EtpA／pcDNA．LTBDNA疫苗免疫Balb／c小鼠，通过建立好的ELISA方法检测并分析疫苗对小鼠产生的体液免疫应答的效果。实验结果通过GraphPadPrism5进行分析和作图，结果反映出了EtpA／LTB蛋白疫苗免疫的小鼠产生的抗体水平显著高于P

6、BS空白对照组(P<0．05)，且制备的四种疫苗均可以引起小鼠体液免疫应答产生特异性的抗体。通过脾淋巴细胞增殖试验分析疫苗对小鼠产生的细胞免疫应答的效果。结果表明免疫后的第四周，免疫组的小鼠脾淋巴细胞增殖变化比较大，其中EtpA／LTB蛋白疫苗组小鼠脾淋巴细胞增殖变化显著强于PBS空白对照组(P<0．05)，pcDNA—EtpA／pcDNA—LTBDNA疫苗组的小鼠脾淋巴细胞增殖变化显著强于pcDNA3．1空载体质粒对照组和PBS空白对照组(P<0．05)。证明制备的疫苗也可以引起细胞免疫。对免疫后的小鼠进行攻毒实验检测制备疫苗的保护性。通过对结果分析

7、表明，制备的四种疫苗对攻毒的小鼠均具有保护性，且加入LTB佐剂的疫苗组的保护率高于未加的，证明了LTB的免疫佐剂的作用。综上所述，含有EtpA与LTB的ETEC核酸疫苗与蛋白疫苗，均具有一定的免疫原性。LTB具有免疫佐剂的效果，制备的疫苗与肠毒素性大肠杆菌C83549株具有交叉保护性。关键词：产肠毒素性大肠杆菌；粘附素EtpA；肠毒素LTB；真核表达；免疫原性：万方数据ConstructionandImmunogenicityAssayofCo-expressionRecombinantPlasmidsincludingEtpAandLTBfromEn

8、terotoxigenicEscherichiacoliAuthor：XiuyuanZhang