s--腺苷甲硫氨酸(sam)在大肠杆菌中的合成

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1、囊萎夫学硕士学位论文S．腺苷甲硫氨酸(SAM)在大肠杆菌中的合成SynthesisofS·adenosy-L·methionine(SAM)in论文答辩日期：2Q里垒生鱼旦§旦学术诚信声明兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。声明人(签名)：魂沈印时间：知咩6习11囱保护知识产权声明本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用

2、影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。作者(签名)：魄现呻导师(签名)：时间：矽，锑6司S．腺苷甲硫氨酸(SAM)在大肠杆菌中的合成摘要S．腺苷甲硫氨酸(SAM)是广泛存在于生物体内的一种重要中间体，参与多种类型的生化反应，主要包括转甲基、转硫和转氨丙基。在细胞内，SAM是由S．腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosy．L．methioninesynthetase，SAMS，EC2．5．1．6)催化三磷酸腺苷(ATP)和底物L．甲硫氨酸(L．Met)合成的。临床研究显示，SAM对肝病、

3、关节炎、阿兹海默症及抑郁症等疾病治疗效果显著，其具有副作用小、易被人体吸收、起效快、安全可靠等优点。尽管SAM具有广泛的应用价值，但SAM价格昂贵使其在临床应用上受到限制。因此，目前研究的重点为开发经济合理的SAM生产工艺及稳定化SAM盐的产品。本论文以含有酿酒酵母的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因(黝粥)的重组毕赤酵母基因组为模板，采用PCR技术获得目的基因SAMS。借助表达载体pET-28a将SAMS基因片段转入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，成功构建重组大肠杆菌表达菌株BL21(pET-28a．SAMS)。将该菌株在摇瓶中以4mg／mL乳糖进行诱导表达，得到

4、46kDa左右的可溶性重组蛋白，Westernblotting鉴定结果显示该重组蛋白为SAMS。采用乳糖对重组大肠杆菌BL21(pET-28a-SAMS)诱导表达，通过对诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间、诱导温度及向培养基中添加L．Met等因素进行优化，确定了重组大肠杆菌BL21(pET-28a．SAMS)的适宜培养条件为：当菌液OD600为1．5时，加入乳糖诱导，致其终浓度为4meCrrlL，诱导温度370C，诱导时间10h，并在LB培养基中添加1g／LL．Met。此时，细胞内SAM的积累量为21．5mg&，分泌到培养基上清中的浓度为47．8mg几。相比酵母表达系

5、统，大大缩短了生产时间及纯化步骤。SAM的生物合成需要ATP作为底物和能源，但由于ATP价格昂贵，向反应体系中直接添加ATP不适宜SAM的实际生产，因此构建高效的ATP再生耦合系统是SAM生物合成的关键。本研究利用重组大肠杆菌BL21(pET-28a．SAMS)与酿酒酵母菌株JM．310混合培养构建ATP再生系统，进而有效合成SAM。由于酵母菌和大肠杆菌所需要的反应条件有一定的差别，因此要构建高效的ATP再生系统必须兼顾两种菌株的反应条件，使其在同一反应系统中都能高效运作；同时为了使ATP再生系统和SAM合成反应系统的最适条件进行平衡，因此对反应系统中的操作条件进

6、行了优化。通过对耦联系统的条件优化，最终确定两种细胞的耦合比为4：1，偶联时间为5h，偶联温度为370C，向反应体系中直接添加体积分数为5％的甲苯作为细胞通透剂，偶联缓冲液的组成包括：200mmol／L磷酸盐缓冲液、200mmol／L葡萄糖、10mmol／L腺苷、30mmol／LM92+、30mmol／LL．Met。在最优条件下所合成的SAM的浓度可达1．7g／L，是对照组的10倍，由此验证了本研究所构建的ATP再生系统用于SAM生物合成的可行性。为了建立SAM的分离纯化工艺，本研究利用大孔弱酸型阳离子交换树脂分离纯化SAM。通过优化SAM粗提液上样pH值的动态吸

7、附结果表明，pH值为4～5时吸附效果最佳；通过对洗脱剂浓度优化结果表明，O．5mol／L的硫酸洗脱效果最佳。最终SAM纯度可达93％，回收率为90％。利用液质联用(LC—MS／MS)进一步对纯化的SAM样品进行了鉴定。为了获得稳定性较高的SAM盐产品，本研究对SAM硫酸盐和1，4．丁二磺酸腺苷蛋氨酸盐分别在40C、300C和450C的稳定性进行了考察，结果表明1，4．丁二磺酸腺苷蛋氨酸的稳定性要优于SAM硫酸盐。因此，建议SAM应以1，4．丁二磺酸腺苷蛋氨酸作为商品化的产品。关键词大肠杆菌，S．腺苷甲硫氨酸，ATP再生系统，分离纯化，1，4．丁二磺酸腺苷蛋氨酸II

8、Synth