响应面分析法优化(r)-扁桃酸发酵培养基

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1、中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（８）：１１２１１７响应面分析法优化（Ｒ）扁桃酸发酵培养基阮文兵陈必钦陈素华陈秉梅许小平（福州大学化学化工学院福州３５０１０８）摘要采用响应面分析法对Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＨＢ２０菌株合成（Ｒ）扁桃酸的培养基成分进行优化。首先利用ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ试验设计筛选出影响（Ｒ）扁桃酸产率的三个主要因素：麦芽糖、蛋白胨和牛肉膏。在此基础上用最陡爬坡路径逼近最大响应区域，再利用ＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎ试验设计及响应面分析法进行回归分

2、析。结果表明，麦芽糖、蛋白胨和牛肉膏浓度与（Ｒ）扁桃酸产率存在显著的相关性，通过求解回归方程得到最佳质量浓度：蛋白胨１１．５０７ｇ／Ｌ，牛肉膏６．７０８ｇ／Ｌ，麦芽糖１０．９０７ｇ／Ｌ，（Ｒ）扁桃酸产率理论最大值达到６６．８７％。经模型验证，预测值与验证试验平均值接近，在优化条件下（Ｒ）扁桃酸产率提高了２５．８７％。关键词（Ｒ）扁桃酸培养基优化响应面分析法中图分类号Ｑ８１９扁桃酸，又名苦杏仁酸、苯羟乙酸、α羟基苯乙酸，提供依据。具有较强的抑菌作用，可用于治疗泌尿系统疾病，同时１材料与方法也是合成血管扩张

3、药环扁桃酸酯、滴眼药羟基苄唑、匹［１］莫林等药物的重要中间体。扁桃酸是一种手性分１．１材料子，其单一对映异构体在药效上存在较大差异；例如１．１．１菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．ＨＢ２０菌株，本实验室从土壤（Ｒ）扁桃酸可用于羟苄四唑头孢菌素侧链的修饰，而中筛选得到。（Ｓ）扁桃酸则可合成Ｓ奥昔布宁，用于治疗尿频、尿急１．２．２培养基种子培养基（ｇ／Ｌ）：蛋白胨１０，牛肉膏［２］和尿失禁。单一对映体（Ｒ）扁桃酸目前主要由化学５，麦芽糖１０，ＮａＣｌ２，ｐＨ７．２。合成和拆分方法制备，该工艺路线复杂、能耗高、污染初始

4、发酵培养基（ｇ／Ｌ）：蛋白胨１０，牛肉膏５，麦芽［３］大。生物不对称转化具有立体选择性高、成本低廉、糖１０，Ｋ２ＨＰＯ４２，ＭｇＳＯ４０．１，ＺｎＳＯ４０．０１，ＭｎＳＯ４０．０１，反应条件温和、操作简便、环境污染较小等特点，是扩ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４５，ｐＨ７．２。大扁桃酸应用领域的根本途径，具有广阔的前景，已成固体斜面培养基：液体种子培养基中加入２％的琼［４］为手性药物研究的热点。脂。本课题从土壤中筛选出一株能选择性将苯乙酮酸１．２方法转化为（Ｒ）扁桃酸的菌株，对映体过量值ｅ．ｅ．＞９９％。１．２．１培养条件种子

5、培养：接１环生长良好的斜面［５７］菌种于装有２０ｍｌ液体种子培养基的５０ｍｌ三角瓶中，本文以ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计法在８种初始培养基成分中确定了３种重要成分后，通过ＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎ的中心３２℃，１８０ｒ／ｍｉｎ条件下摇瓶培养２０ｈ。组合设计原理，以最陡爬坡实验［８］所得的值为中心点，发酵培养：将培养好的种子按１％（Ｖ／Ｖ）的接种量对筛选出的重要因素进行中心组合试验设计，确定了接入２０ｍｌ初始发酵培养基（５０ｍｌ三角瓶）中，３２℃，最佳的发酵培养基，为生物合成（Ｒ）扁桃酸的工业化１８０ｒ／ｍｉ

6、ｎ条件下摇瓶培养２０ｈ后，加入底物苯乙酮酸１０ｍｍｏｌ／Ｌ，继续转化２４ｈ，取发酵液进行液相色谱分析。收稿日期：２０１００１０５修回日期：２０１００５２７福建省自然科学基金资助项目（２００８Ｊ０１００）１．２．２分析方法高效液相色谱（ＨＰＬＣ）测定：色谱通讯作者，电子信箱：ｘｕ＠ｆｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ柱：ＨｙｐｅｒｓｉｌＣ１８柱（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ），流动相：甲２０１０，３０（８）阮文兵等：响应面分析法优化（Ｒ）扁桃酸发酵培养基１１３醇２５ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾缓冲液（内含６ｍｍｏｌ／

7、Ｌ四丁表示：基溴化铵，ＮａＯＨ调ｐＨ至７．０）（１５∶８５，Ｖ／Ｖ），检测波Ｙ＝β＋βＸ＋βＸ＋βＸ＋βＸＸ＋β０１１２２３３１２１２１３２２２长：２２０ｎｍ，流速：１ｍｌ／ｍｉｎ，柱温：室温，进样量：２０μｌ。ＸＸ＋βＸＸ＋βＸ＋βＸ＋βＸ（１）１３２３２３１１１２２２３３３产物得率（ｙｉｅｌｄ％）＝扁桃酸生成浓度／初始苯乙式中Ｙ为预测最佳响应值，β为回归系数，自变量酮酸浓度×１００％。Ｘ、Ｘ、Ｘ为主要影响因素。多项式模型方程拟合的性１２３高效毛细管电泳（ＨＰＣＥ）测定：检测波长２１４ｎｍ，质由确定系数Ｒ２表达

8、，其统计学上的显著性由Ｆ检验缓冲液为含１５０ｇ／Ｌ羟丙基?β?环糊精的１００ｍｍｏｌ／Ｌ确定。Ｔｒｉｓ磷酸溶液（ｐＨ７．６），分离电压２０ｋＶ，分离柱温２结果与讨论２０℃。对映体过量值（ｅ．ｅ．％）＝（［Ｒ］－［Ｓ］）／（［Ｒ］＋２．１应用ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ设计试验筛选重要因素［Ｓ］）×１００％，其中：［Ｒ］和［Ｓ］是Ｒ型和Ｓ型扁桃酸本试验选用实验次数Ｎ＝１２