响应面法优化地衣芽孢杆菌a2发酵培养基

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1、响应面法优化地衣芽孢杆菌A2发酵培养基为了提高地衣芽孢杆菌A2（BacilluslicheniformisA2）发酵液的活菌含量，采用Hackett-Burman设计法和响应面分析法对其发酵培养基进行优化。先用Plackett-Burman设计从8种原料中筛选出对活菌含量有显著影响的因素，再用最陡爬坡试验及Box-behnken设计进一步优化。结果表明，MgSO4·7H2O、酵母粉和尿素是影响发酵液活菌含量的显著因素，优化后的培养基为：可溶性淀粉5g／L，尿素1．29g／L，K2HPO46g／L，K

2、H2PO43g／L，MnSO4·H2O0．2g／L，MgSO4·7H2O0．41g／L，豆粕10g／L和酵母粉0．99g／L。在此条件下，发酵液中A2的活菌含量可以从优化前的4．73×10^10CFU／mL提高到1．30×10^11CFU／mL。酵母菌的培养大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5一6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（

3、这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。常用的培养基有：(一)麦芽汁培养基的配制1．培养基成分新鲜麦芽汁，一般为10-15波林。2．配制方法(1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。(2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现

4、，即表示糖化完全)。(3)糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加水20m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。(4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH至6．4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10-15波林后使用。(5)如配固体麦芽汁培养基时，加入2％琼脂，加热融化，补充失水。(6)分装、加塞、包扎。(7)高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。（二)马铃薯葡萄糖培养基的配制1、培养基成分

5、马铃薯20g葡萄糖2g琼脂1.5-2g水100ml自然pH2．配制方法(1)配制20％马铃薯浸汁取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1。80℃浸泡lh，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100Pa灭菌20min。即成20％马铃薯浸汁，贮存备用。（2)配制时，按每100m1马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化并补足失水。(3)分装、加塞、包扎。(4)高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。(三)豆芽汁葡萄糟培养基的配制1．培养基成分黄豆芽10g葡萄糖5g琼脂1.5-

6、2g水100ml自然pH2．配制方法(1)称新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100m1水，小火煮沸30min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。（2)配制时，按每100m110％豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化，补足失水。(3)分装、加塞、包扎。(4)高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。(四)察氏(czapck)培养基的配制1．培养基成分蔗糖3gNaN030.3gK2HPO40.1gKCl0.05gMgSO4·7H2O0.05gFeS040.001g琼脂1.5-2

7、g蒸馏水100ml自然pH2．配制方法(1)称量及溶化量取所需水量约2／3左右加入到烧杯中，分别称取蔗糖、NaNO3、K2HP04、KCl、MgSO4。依次逐一加入水中溶解。按每100ml培养基加入1ml0.1％的FeS04溶液。（2）定容候药品全部溶解后，将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。（3）加琼脂加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。(4)分装、加塞、包扎。(5)高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。（五）YPD培养基YPD或YPED，：YeastExtractPeptoneDextroseMe

8、dium(1L)，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，加入琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基，用于酵母菌的培养。1、配方：1%YeastExtract（酵母膏），2%Peptone（蛋白胨），2%Dextrose(glucose)（葡萄糖），若制固体培养基，加入2%琼脂粉2、配制方法：（1）溶解10gYeastExtract（酵母膏）,20gPeptone（蛋白胨）于900ml水中，如制平板加入20g琼脂粉（2）高压121度20min（3）加入100ml10×De