mir-27a通过靶向kras抑制食管鳞状细胞癌增殖和侵袭

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofDoctormiR-27ainhibitstumorproliferationandinvasionthroughtargetingKRASinesophagealsquamouscellcarcinomaByLinanZhuSupervisor：Prof．YanSunQingxiaFanOncologytheFirstAffiliatedHospitalMay2014原

2、创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承．担。学位论文作者：嗍弘c忙上月叼闩学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借

3、阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位敝黼*弗同期：w印年r月q日摘要miR．27a通过靶向KRAS抑制食管鳞状细胞癌增殖和侵袭博士研究生：朱利楠导师：孙燕教授樊青霞教授郑州大学郑州450000食管癌(E(：)是临床上常见的一类消化系统恶性肿瘤。高通量检测发现多种微小RNA(m

4、iRNA)在正常组织与肿瘤组织中的表达水平具有明显的差异，参与了食管癌的发生发展进程。miR．27与多种肿瘤的发生密切相关，但尚无miR一27在食管鳞状细胞癌(ESCC)发生发展中作用的报道。本研究首先检测miR．27a与食管鳞状细胞癌的相关性，然后预测并验证miR．27a可通过其靶基因KRAS基因调控Ras瓜a蹦EUERK信号通路，表明miR．27a表达降低促进食管鳞状细胞癌的增殖和转移，为食管鳞状细胞癌提供了新的可能的治疗靶点。第一部分：miR-27a在食管鳞状细胞癌中的表达及I临床意义研究方法

5、1．在基因表达数据库(CEO)中检索食管鳞状细胞癌的miRNA芯片数据并进行分析。对44例食管鳞状细胞癌和32例食管腺癌中癌组织和癌周正常组织中miR一27a和miR．27b的表达量进行分析。2．采用RT-PCR检测25例确诊食管鳞状细胞癌并伴有淋巴结转移患者的癌组织及其配对癌周正常组织中miR一27a的表达。3．采用RT-PCR检测6种食管鳞状细胞癌细胞系及正常食管上皮细胞中miR一27a的表达。摘要结果1．检索GEO数据库，发现在伴有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌病例中，miR-27a的表达显著下调

6、(n--20，p=0．041)，而miR一27b改变不明显(n=24，p=0．785)。在32例食管腺癌中，无论有无淋巴结转移，miR一27a或miR．27b表达较癌周正常组织均无显著差异。2．在确诊食管鳞状细胞癌并伴有淋巴结转移患者的癌组织中miR．27a的表达显著低于癌周正常组织。3．6种食管鳞状细胞癌细胞系中miR．27a表达较正常食管上皮细胞均显著降低，其中TE．1细胞中miR一27a表达最低。结论miR．27a在伴有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌组织中表达降低，且在6种食管鳞状细胞癌细胞系中均

7、表达降低，表明miR-27a可能参与食管鳞状细胞癌的发生和转移过程。第二部分：miR-27a在食管鳞状细胞癌组织、细胞中靶基因的研究研究方法1．采用TargetScan靶基因预测软件，预测miR-27a可能靶向KRAS基因。2．构建KRAS基因3'-UTR片段双荧光素酶报告载体(野生型和突变型)，分别与miR．27a或Scramble质粒共转染HEK293细胞，检测荧光值。3．在TE—l细胞中转染miR-27a前体、miR．27a抑制剂及其各自对照，分别采用RT-PCR和Westernblot检测K

8、RASmRNA和KRAS蛋白的表达变化。4，通过RT-PCR对25例确诊食管鳞状细胞癌并伴有淋巴结转移的患者癌组织进行miR一27a检测，并通过westernblot检测KRAS蛋白的表达。结果1．K1LAS基因Y-UTR有两个序列片段可能与miR一27a结合，分别是343—349和4583—4589位点。2，双荧光素酶实验证明：在转染野生型片段的细胞中，miR-27a高表达显著抑II摘要制荧光素表达；当将结合位点突变后，上述抑制作用丧失。3．miR一27a高表达抑制