jph2敲减抑制小鼠心肌细胞sk2蛋白的表达

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1、万方数据AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterKnockdownofJPH2suppressesexpressionofSK2proteininmousecardiacmyocytesBy：WenjingGuoSupervisor：Prof．QianZhangPhysiologyMedicalSchoolofZhengzhouUniversityMay，2014万方数据原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取

2、得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：却嗡醐：功泸9学位论文使用授权声明日本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手

3、段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：辞。骛日期：2讹年6月日万方数据摘要JPH2敲减抑制小鼠心肌细胞SK2蛋白的表达硕士生：郭文静导师：章茜教授专业：生理学郑州大学基础医学院河南郑州450002研究背景与目的：细胞膜表面与细胞内质网(SR／ER)离子通道之间的功能交通是可兴奋细胞的重要特征，而位于二者之间的耦联膜复合体(junctionalmembranecomplexes，JMCs)是实现

4、其有效交通的结构基础。Junctophilin(JP，JPH)是近年人们认识的与JMC形成有关并具有其特性的蛋白分子，它通过耦联细胞膜表面与内质网上的离子通道，维持细胞NCa2+的稳态。在哺乳类动物中，JPH已鉴定出JPHl，JPH2，JPH3_；fnJPH4四个亚型，而JPH2主要位于心肌细胞。已有研究表明JPH2可易化细胞膜上的电压门控钙离子通道(voltaged—gatecalciumchannels，VGCCs)和肌浆网上的兰尼碱受体(ryanodinereceptors，RyRs)受体之间的功能性耦联。RyRs是

5、真核细胞肌浆网膜上特有的钙释放通道。在哺乳类动物的组织中有RyRl，RyR2，RyR3三种亚型．在心肌细胞，通过RyR2释放细胞内钙完成心肌细胞兴奋～收缩耦联过程。小电导钙激活钾通道(smal卜conductencecalcium—activatedpotassiumcha枘nels，SK)是存在于几乎所有可兴奋细胞的非电压依赖性、通过细胞内Ca”激活的K+通道。根据SK2对蜂毒明肽药理学特性的不同，可划分为4个亚型，分别为SKl、SK2、S1／．3和SK4通道。存在于心肌细胞膜上的SK2通道参与动作电位复极化的构成，并维

6、持心脏传导组织的节律性。我们实验室之前的研究表明心肌RyRs敏感的ca”释放通道与SK2通道之间具有功能耦联。结合近年报道的JPtt结构和功能特征，心肌RyR2与SK2通道的功能交通是否与JPH2分子耦联相关?为验证万方数据摘要这一假设，我们采用RNA干扰技术，沉默心肌细胞JPH2基因，观察JPH2的表达及其对小鼠心肌细胞SK2表达的影响，为进一步研究心肌SK通道与RyR受体之间功能耦联的分子机制奠定基础。实验方法：1．采用计算机分析软件及已有的文献报道设计2条针对小鼠JPH2mRNA的靶序列(21shRNA片段)，制备表

7、达JPH2-shRNA的重组慢病毒表达载体。通过PCR和阳性克隆测序对重组子进行鉴定，并将重组子与慢病毒包装质粒共转染293T细胞，得到重组慢病毒颗粒为Lenti—siJPH2—1和Lenti—siJPH2—2：2．培养新生小鼠心肌细胞，将重组慢病毒颗粒感染新生小鼠心肌细胞，48h后在倒置显微镜下观察绿色荧光，并通过流式细胞术检测心肌细胞的转染效率；3．通过qRT—PCR检测重组慢病毒颗粒感染的新生小鼠心肌细胞JPH2mRNA表达水平；4．通过qRT—PCR和Westernblotting检测重组慢病毒颗粒感染的新生小鼠心

8、肌细胞SK2mRNA和蛋白表达水平；5．统计学处理：利用SPSSl7．0软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析比较不同组之间的差异，以a=0．05为检验水准。结果：1．PCR和阳性克隆测序证实重组JPH2慢病毒表达载体构建成功；2．新生小鼠心肌细胞培养2—3d可长成单层并形成细胞簇，镜下观察培养的心