isg15蛋白稳定表达细胞系的构建及其与猪源bvdv--2相互作用初步研究

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1、ISGl5蛋白稳定表达细胞系的构建及其与猪源BVDV．2相互作用初步研究EstablishmemofMDBKstablecelllineexpressingISG15proteinandapreliminarystudyoftheinteractionbetweenISG15andprocineBVDV-2研究生：廖金虎导师：朱国强教授廖金虎：ISGl5蛋白稳定表达细胞系的构建及其与猪源BVDV-2相互作用初步研究ISGl5蛋白稳定表达细胞系的构建及其与猪源BVDV．2相互作用初步研究专业：微生物学研究生：廖金虎导师：朱国强教授IIIIIqlktkl

2、llltllttlllC[tlillll]lqllllllY2632658中文摘要牛病毒性腹泻病毒(BovineⅥralDiarrheaVirus，BVDV)是黄病毒科瘟病毒属成员，除感染牛外，它还能引起猪、羊、鹿以及多种野生动物发病。近年来，猪群感染BVDV的现象日益严重，而且主要是持续性感染。如果母畜在孕期前30～120天内感染非致细胞病变型(noncytopath畦．NCP)BVDV，此时胎儿免疫系统尚未发育完全，不能识别外源NCP型BVDV为抗原，因此容易造成胎儿持续感染BVDV，成为主要传染源之一。研究表明只有NCP型BVDV感染才能产生持

3、续性感染，而病毒逃逸细胞先天免疫是建立细胞持续感染的第一步。因此，了解猪源BVDV逃逸细胞先天免疫的机制，有助于我们解释BVDV持续性感染的作用机制，从而制定更全面的BVDV防控措施。ISGl5(interferon—stimylatedgenel5，ISGl5)是泛素样蛋白(UBL)家族的重要成员，与干扰素有密切关系，是干扰素诱导表达最强的ISG之一，也是第一个被鉴定的ISG。ISGl5可抑制多种DNA病毒和RNA病毒的增殖，在抗病毒免疫中具有不容忽视的地位，现已证明ISGl5在抗1型HIV病毒、埃博拉病毒、乙型流感病毒等多种病毒过程中起重要作用。

4、本研究通过克隆牛源ISGl5基因，高效表达重组蛋白并制备抗ISGl5多克隆抗体：同时构建稳定表达ISGl5蛋白的细胞系。在此基础上，探析了猪源BVDV-2与ISGl5蛋白的相互作用，为进一步研究ISGl5抗病毒机制和猪源BVDV-2逃逸细胞先天免疫机制奠定了基础。研究的主要内容分为以下3部分：1．ISGl5基因的原核表达及多抗血清的制备本试验利用人重组干扰素IFNc【．-2A刺激MDBK细胞，并提取细胞总RNA。通过RT-PCR扩增牛干扰素刺激基因ISGl5，将其克隆入pCold．q-F表达载体中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达

5、后，获得约70KDa的可溶性ISGl5重组蛋白并用试剂盒进行纯化。经BCA法测定纯化的ISGl5重组蛋白浓度为lmg／ml。用纯化的ISGl5扬州大学硕士论文重组蛋白免疫ICR小鼠，制备抗ISGl5多抗血清；四免后断尾采血，用间接ELISA方法测定多抗血清效价为l：102400。Westernblot鉴定表明，ISGl5多抗血清能特异性识别纯化的ISGl5重组蛋白。2．稳定表达ISGl5蛋白的细胞系的构建与鉴定本研究构建了稳定表达ISGl5蛋白的MDBK细胞系，为进一步研究ISGl5蛋白与猪源BVDV-2的相互作用奠定基础。通过RT-PCR扩增ISG

6、l5基因片段，将其克隆到真核表达载体pECl29中，筛选出阳性重组真核表达质粒pECl29．ISGl5。利用LipofectamineLTXandPlusTMReagent试剂盒将pECl29．ISGl5转染MDBK细胞并用终浓度为70099／mLG418进行筛选。约两周后，将筛选获得的单克隆细胞团进行扩大培养并传代。利用ISGl5多克隆抗体对传至第十代的筛选细胞系进行间接免疫荧光检测，发现整个视野内的细胞都能激发绿色荧光。Westernblot鉴定结果亦表明，ISGl5多克隆抗体能与第十代筛选细胞系的总蛋白发生特异性反应，经DAB显色后出现一条约1

7、5KDa的条带。上述结果说明我们成功构建并筛选出了稳定表达ISGl5蛋白的MDBK细胞系，命名为E53，为后续实验顺利开展奠定了良好基础。3．ISGl5和猪源BVDV-2相互作用探究本研究旨在探究ISGl5蛋白与猪源BVDV-2的相互作用关系，为后续研究猪源BVDV-2逃逸细胞先天免疫机制奠定基础。将猪源BVDV-2分离株SH．28分别感染MDBK细胞和稳定表达ISGl5蛋白的E53细胞后，收集不同时间点的病毒液并测定其TCID50；绘制SH一28在不同细胞系中的病毒滴度增殖曲线图，发现ISGl5蛋白对SH．28的复制有明显抑制作用。利用荧光定量PC

8、R检测SH．28感染后E53细胞内ISGl5蛋白的表达情况，结果表明，与空白对照相比较，SH．28感染E53