catheps in v作为保护组织损伤抗炎新型靶点的前期机制

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1、万方数据万方数据原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：枷日期：坐年』月曼日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可

2、以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。日期：业年羔月』日万方数据八年制博士学位论文中文摘要CathepsinV作为保护组织损伤／抗炎新型靶点的前期机制摘要背景：胞外的双硫键HMGBl(高迁移率族蛋白B1)是一种关键的损伤相关模式分子DAMP，在众多急慢性疾病中，通过细胞表面Toll样受体4(TLR4)介导病理性炎症：HMGBl．TLR4信号通路的特异性抑制剂可以选择性阻断内源性炎症激活的早期事件，为相关炎症性疾病提供新的治疗药物。基于H

3、MGBl．TLR4一TNF．0【信号轴的细胞高通量筛选发现，第一代HIV蛋白酶抑制剂Saquinavir(SQV)可有效阻断HMGBl-TLR4激活后的炎症因子(TNF．仅和IL．6)释放。我们前期实验发现SQV预处理能显著减轻肝脏热缺血再灌注模型(LiverIschemia／Reperfusionhljury,IR)的肝损伤，而HMGBl-TLR4信号通路正是LiverIR模型的核心通路之一，同时鉴定到半胱氨酸蛋白酶V(CathepsinVCTSV)是SQV的哺乳动物靶点之一。而细胞实验与体外重组蛋白实验均证实CTSV与TLR4存在相互作用且可

4、被SQV阻断，CTSV低表达致使HMGBl-TLR4激活受限，揭示CTSV在TLR4信号通路中的未知作用，提示SQV通过靶向CTSV而干预HMGBl．TLR4信号轴及其介导疾病。目的：本研究中，我们拟深入探究CTSV与TLR4相互作用的实质及其在TLR4信号通路中的作用机制，同时全面评估SQV抑制HMGB1-TLR4信号通路和保护动物炎症模型的具体机制，为开发CTSV为新型抗炎靶点和扩大SQV适应症提供实验基础。。方法：以SQV和另一种己知的CTSV抑制剂SID26681509(SID)为靶向CTSV的药物探针，分别评估SQV／SID对TLR4信

5、号通路受体水平的早期事件(配体．受体结合、受体二聚化、TLR4一MyD88和TLR4一TRIF活化)以及下游公共通路即NF．r．B水平的影响，以期在TLR4信号通路中定位CTSV。同时分别评估CTSV低表达和SQV／SID抑制CTSV对其它模式识别受体(TLRl／2、TLR3、IL一1R)介导信号通路的影响，与前一部分内容相互佐证。运用点突变结构域变异体的方法探究CTSV与TLR4相互作用所涉及的结构域，决定CTSV蛋白酶活性是否参与TLR4信号通路，明确SQV抑制CTSV的具体机制。同时观察SQV预处理对SQV保护肝脏缺血再灌注模型的必要性，以

6、评估CTSV抑制剂用于临床情况的可行性。结果：我们发现SQV在受体水平特异性抑制TLR4介导的万方数据八年制博士学位论文中文摘要MyD88．IRAK4／1活化和TRIF．IRF3的活化，而在NF—r,_13水平非特异性地抑制TLRl／2、3、4和IL．1R以及TNFR引起的NF．v．_13活化或TNF—a释放。SID作为特异性CTSV抑制剂同样具有上述特性。而CTSV低表达可造成MyD88依赖性的TLRl／2、TLR4下游TNT—a生成减少，但对TRIF依赖性的TLR3通路无影响。在相同浓度时SQV抑制TLR4一MyD88．IRAKl激活的程度强

7、于S1D，与两者在阻断CTSV-TLR4相互作用的强弱趋势一致，与两者在抑制CTSV蛋白酶活性的强弱趋势相反。同时，酶活性减低的CTSV变异体(酶结构域变异体C138S，N端糖基化变异体N292Q)依旧可与TLR4相互作用。此外，仅在灌注期给予SQV依旧可以保护HMGBl一TLR4介导的肝脏缺血再灌注损伤。结论：本研究进一步确定CathepsinV是FDA认证药物HIV蛋白酶抑制剂SQV特异性拮抗HMGB1．TLR4介导炎症的新型靶点，并揭示CTSV参与TLR4受体水平对MyD88的募集，而SQV的作用方式很可能是直接阻断CTSV与TLR4的相互

8、作用。同时发现了SQV和SID可分别从TLR4受体水平和NF—v．B水平抑制HMGBl．TLR4炎症通路活化，且即使不预处理，SQV依旧