参与脑缺血损伤和保护机制的蛋白靶点筛查

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1、第一军医大学博士学位论文参与脑缺血损伤和保护机制的蛋白靶点筛查姓名：陈亮申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：高天明20070520博士学位论文参与脑缺血损伤和保护机制的蛋白靶点筛查博士研究生：陈亮指导教师：高天明摘要脑血管疾病是指供应脑部血液的血管的疾病所致的一种神经系统疾病，以其高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率成为严重威胁人类生命与健康的主要疾病之一，主要包括缺血性和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中最常见，约占70％．80％。目前，脑卒中的有效治疗药物十分单一，并且因为苛刻的治疗时间窗和细胞毒副作用而使其应用受到限制。脑卒中的临床治疗急切需要新的理论基础和分子靶

2、点。脑卒中在发生后的几小时到几天内就会有大量复杂的病理生理变化。在缺血中心区，血流缺失、—^船和能量储存低水平、离子紊乱和代谢障碍都很严重，细胞在几分钟内就死亡了。但是在中心区的周围——半影带——因为侧枝循环而仍然存在少量血流，损伤也因而轻微些，通常表现为凋亡样的迟发性神经元死亡。因此，针对半影带细胞相对慢速的主动死亡机制在临床上发展治疗手段是合理可行的选择。为了找到新的参与细胞损伤(CAl区损伤后上调的和CA3区损伤后下调的蛋白)和内源性保护(CA3区损伤后上调的和CAl区损伤后下调的蛋白)的分子机制，本研究在短暂性全脑缺血神经元迟发性死亡模型上，选择缺血损伤敏感性海马CA

3、l区及其相邻的缺血损伤非敏感性CA3区进行了蛋白表达水平观察。脑卒中过程中细胞的死亡至少有三个基本的机制：兴奋性毒性和离子失平衡，氧化／亚硝化应激，凋亡样的细胞死亡。这些机制之间是相互交叉，而非孤摘要立的；作用对象也是广泛的，包括了神经细胞、胶质细胞和血管元件；在亚细胞水平上，它们涉及线粒体、核、细胞膜、内质网和溶酶体等多个细胞器已知一些蛋白分子(包括离子通道、线粒体呼吸链成分、细胞内信号转导分子)的表达变化参与甚至决定了这些机制的进行。在以上这些主要已知的细胞死亡途径中，线粒体是已知最重要的细胞器之一。线粒体包含了一系列促凋亡因子，包括细胞色素C、继发性线粒体源性caspa

4、se激活因子(secondarymitochondrialactivatorofcaspase。Smac／Diablo)、核酸内切酶、A腰等，线粒体上转运孔道的形成，氧化磷酸化相关成分的变化都是线粒体成为关键细胞器的原因。为了找到新的参与细胞损伤或者保护机制的线粒体组分，本研究在短暂性全脑缺血神经元迟发性死亡模型上，提取纯化线粒体后选择观察了缺血前后线粒体蛋白表达羞的变化。在现有的蛋白质组学技术平台中，双向电泳(twodimensionalelectrophoresis，2DE)技术已经是一种成熟的蛋白分离技术，因其能够同时分离和显示数以千计的蛋白这一独特优势，以及相关仪器和

5、试剂成本相对低廉，成为大多数研究者的首选。2004年新发明的“SilverBlue”染色方法是对1988年NeuhoffJY法的改进，这种胶体考马斯亮蓝G．250染色法已经能达到ng级敏感度，改变了以往mg级上样量也只能得到不足一千个点的状况。应用这种方法，我们在lmg总l-样量时常能得到两千余蛋白斑点。并且其很好的可重复性是银染很难达到的。研究采用的质谱方法是基质辅助激光解吸电离．飞行时闯质谱(matrixassistedlaserdesorption／ionizationtime-of-flightmassspectrometry，MAU)I-1DF．MS)和时间串联质谱

6、(MAIDl-1DF／1DF．MS)，后者可以将酶解肽段进一步解离成次第减少一个氨基酸的肽段，从而实现从头测序(detbOPOsequencing)，得到多个选检肽段的完整氨基酸序列信息，进而推断蛋白质序列信息，提高了待测蛋白的检出成功率和准确率。以往有多项研究观察脑缺血损伤相关的基因和蛋白表达变化，所使用的技术方法包括寡核营酸芯片、表达序列标签cDNA_签片、商通量的免疫印迹法、双Ⅱ博士学位论文向电泳联用可定量的同位素标记亲和标签、表面增强激光解离，离子化·时间飞跃质谱等，研究材料多为全脑、全海马组织、培养皮层细胞等，也有研究在间歇性缺氧的大鼠模型上，对缺氧损伤敏感性截然不

7、同的CAl和CA3区采用2DE-MS筛选到一些骨架蛋白、应激相关蛋白、凋亡相关蛋白变化，但是尚未见到使用蛋白质组学方法对CAl和CA3区、海马组织线粒体在脑缺血后变化规律进行研究的报道。本研究的技术路线主要依靠双向电泳和质谱技术筛选可能的候选靶分予，并重点选择进行了免疫学的验证。假手术组和四血管夹闭模型导致大脑缺血再灌注损伤的大鼠被经左心室灌注固定后，制作海马组织冰冻切片并进行神经元特异的尼氏染色，随后对存活神经元(胞体饱满、染色均匀者)进行计数，比较损伤后24,b对和7天是否比假手术组有神经元数量变化