人胰岛素突变体基因的融合表达

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1、维普资讯http://www.cqvip.com山西医科大学学报(JShanxiMiv)生!Q(·445·文章编号：1007—6611(2OO4)O5—0445—04人胰岛素突变体基因的融合表达于保锋1，解军，陈显久，常冰梅，张悦红，胡晓年，牛勃，程牛亮(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，太原030001；协和医科大学基础研究所)摘要：目的以pTXB1作为融合表达载体，构建人胰岛素突变体(M-insulin)的基因表达克隆，表达及纯化。方法基因合成胰岛素突变体的cDNA序列，酶切后装入融合表达质粒pTXB1，基因测序正确后转化大肠杆菌BL21(

2、DE3)，诱导表达，初步纯化。结果融合蛋白的分子量约为33000，表达量占菌体总蛋白的50％以上。融合蛋白主要以包涵体的形式存在，洗涤包涵体后融合蛋白的纯度达到85％以上。Western—blot表明表达蛋白具有胰岛素抗原活性。活性测定显示，每升诱导培养后的菌液表达产物中，具有的放射免疫活性为0．5U。结论成功地构建了人胰岛素突变体的融合表达体系，为进一步的研究奠定了基础。关键词：人胰岛素突变体；克隆，基因；基因融合表达中图分类号：q813．2文献标识码：AExor~lonofhumaninsulinmutantgeneinfusionprotein

3、formYUBao-feng，XIEJun，CNXian-jiu，etal(DeptofBiochemistryandMolecularBiology，Shan．~MedicalUniversity，Taiyuan030001，China)Al~-traet：ObjectiveTooorlstrtlCtexpressioncloneofhumaninsulinmutant，M—insulin．MethodscDNAofM-insulin啪achieyedbygenesynthesis，andthenprokaryoticexpressionvecto

4、rpTXB1一M—insulinwasconstructed．Theexpressionpla~nidWaSi．dentifiedwithP(、RandDNAsequencin4~．pTXB1一M-insulinWaStransformedintoE．co／iBL．21(DE3)．TheexpressedproteinWaSi—dentifiedbySDS-REandWestern—blot．RadioimmunoassayWaSusedtOtesttheimmuneactivityofM-insulinfusionprotein．ResultsI)

5、NAsequencingdemonstratedsequenceofM—insulingeneWaSaccHrate．SDRGEanddensitometricscananatysisshowedthemoleculanⅣeightofM-insulinfusionproteinwasabout33000anditsexpressionlevelwasabove50％oftotalbacterialproteins．Western-blotdemonstratedM-insulinfusionproteincouldspecificallybindi

6、nsulinantibody．Radioimm~yshowedtheradioim—murteactivityofM-insulinfusionproteinWIltS0．5unitperlitrebacterialliquid．Conclus／onExpressiondOlleofhumaninsulinmk1．tantissuccessfullyconstructed．Keywords：humaninsulinmutant；cloning，gene；genefusionexpression目前已有基因工程人胰岛素上市，但胰岛素长教授惠赠；克隆载体

7、pBluescriptIISK(+)，购自大效的问题亟待解决，长效胰岛素突变体的研究是目连宝生物有限公司。前国内外的热点。设计长效突变体时主要考虑到胰1．2工具酶与试剂盒限制性内切酶，Taq酶，岛素的自身聚合能力，使其倾向于形成多聚体，例如Western-blot试剂，P(、R产物回收试剂盒等均购于向胰岛素分子中引入正电荷或消除原有负电荷以提Promega公司；胰岛素放免试剂盒购于海军总医院高其等电点，使其接近于人体液的pH值，进人人体放射免疫技术中心；其他试剂均为国产分析纯。组织后却迅速形成晶体或无定形沉淀，缓慢溶解成2方法单体或二聚体释放人血液，

8、使胰岛素在人体中长时2．1人胰岛素突变体的氨基酸及基因序列设计间维持一定的浓度_lJ。本实验通过改变胰岛素降