重组腺相关病毒神经肽y基因转染对红藻氨酸致痫大鼠癫痫发作及其海马组织中p35表达的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文重组腺相关病毒神经肽Y基因转染对红藻氨酸致痫大鼠癫痫发作及其海马组织中P35表达的影响姓名：张新颖申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：娄燕；李文玲201203中文摘要重组腺相关病毒神经肽Y基因转染对红藻氨酸致痫大鼠癫痫发作及其海马组织中P35表达的影响摘要癫痫是由于多种原因引起的脑细胞群异常同步化放电所致的突然性、反复性和短暂性的脑功能障碍综合征，可以表现为运动、感觉、意识、精神等多方而的功能障碍。中国目前至少有700多万癫痫患者，其中约有20％的癫痫患者为药物难治性癫痫，成为临床

2、治疗中的难点。长期反复癫痫发作不仅严重影响了癫痫患者的身体健康和正常生活质量，也给患者家庭及社会带来巨大的负担和压力。目前，药物难治性癫痫主要采月j外科手术治疗，但是外科手术只能切除患者致瘸吐的发作起始区，并未完全改变嘛内神经细胞的过度兴奋状态和相关离予通道异常?而且，外科手术本身存在着一定的风险，例如麻醉意外、出血、!誊．要!、汐、乡=i

3、障j碍及肢体偏瘫等。随着对癫痫发痫机制认识的不断深入以及分子生物学技术的发展，基因治疗为彻底治愈癫痫带来了新的希望。资料显示，神经臌Y(neuropeptideY．NPY

4、)在中枢神经系统中主要分布在大脑皮层、海·j、匠《虮下丘脑及脑干等处，尤以海马内浓度最高，NPY及其受体与：鲡痫的发生密切相关，受到广泛的关注，其在各利，癫痫动物模型中的作刚非常复杂，常因镆驾!或给药途径不同出现不一致甚至相互矛盾的实马惫结果。本研究以NPY为治疗基因，以重红{豚相关病毒为载体，将NPY基因转染到脑组织特定靶区(本研究的前期实验已证明rAAV2／1一NP、CEGFP在撅痫}芮理状态1-的脑组织中可以实现有效表达，n脑室注射途径优于海马注射途径，故刁<实验主要采取脑室注射途径)，观察NPY基冈过

5、表达对红藻氨酸诱导慢性癫痫大鼠发作的影响，并进⋯步运用荧光定量PCR技术、免疫组织化学技术来分析NPY调控癫痫发作后海马组织中p35表达的变化。目的：观察rAAV2／1．NPY—EGFP基冈转染对火鼠癫痫发作、EEG及其海马红i织。{Jp35表达的劬响，以探讨其在癫痫发病机制中的作用以及中文摘要NPY基因治疗慢性癫痫的可能机制。方法：72只Wistar健康雄性成年大鼠，随机分为对照组(n=24)和点燃组(n=48)。对照组：海马CA3区注射等量的生理盐水；点燃组注射KA1．59l(o．4ug／g])5次造成慢

6、性癫痫大鼠模型后，又随机分为KA组(n=24)和rAAV2／1．NPY—EGFP组(n=24)(本研究的前期实验已证明rAAV2／1一empty。EGFP对实验结果无明显影响)。制模过程中出现死亡或不符合模型标准的均及时剔除，然后随机补充，保证每组动物24只。rAAV2／1．NPY。EGFP组向脑室注射lOBl的rAAV2／1．NPY．EGFP，滴度为5x10¨v．g．／lnl，KA组注射等量的生理Jih．7J＼。分别于注射后2w和4w观察大鼠的癫痫发作情况及发作潜伏期．EEG撅痂波的频率和波幅，随后取材月j

7、荧光定量PCR技刁：{铡i9j≮限海马组织I{1p35mRNA表达，免疫组织化学技术检测p35蛋}，^j?≮遮。结果：11．AA＼?2／1．NI'Y．EGFP组大鼹随觋祭Hr、J闻的延长，发作程度逐渐减轻，与KA缉j、f．j．纠I【：，于4＼s，}{{‘，大鼠发作瘟状明显减轻(P<0．05)，芨iI潜伏崩逗．K(P<-O．05)，脑电隆j煽(；j丽j皮放电频率减少，波幅降低。2KA纽和1·AAV2／I—NPSCEGFP组大鼠在注射后2w和4wNPY升高，与对照纽相}l=差异有显著性(P<0．05)。在注射后4

8、w，，rAAV2／1．NPY．1：GFP组NPY的mRNA及蛋白表达均高于KA组(P<0．05)。3在注射后2w和4w，KA绁海j与组织中P35的mtLNA及蛋Fj表达均显著升高，与对照组相比差：片有显著性fP<0．05)。rAAV2／1．NPY-EGFP组海马组织中P35的mRNA及赁白表达逐渐曙低，于4w时，与KA组相比，有显著·阡差异(Jp

9、P基因转染抑制了癫瘸大鼠海马组织中P35的表达，NPY有可能通过下调海马组织中P35的表达水平来发挥抗癫痫和神经保护作用。关键词：神经肽Y；腺相关病毒裁体；基因转染；癫痫；P352英文摘要TheeffectsofneuropeptideYgenetransfectionusingrecombinantadeno．associatedvirusvectoronseizureinratmodelindu