四川大学-生物技术-综合实验报告-学生版

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1、生物技术综合实验甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达学生：学号：同实验者：<研究背景>谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH具有多种重要生理功能,抗自由基和抗氧化应激作用,保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶,可以调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用,说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。实验一甘薯叶片RNA提取一、实验目的1.了解真核生物RNA提取的原理；2.掌握Trizol提取的方法

2、和步骤。二、实验原理Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于

3、解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少。23三、实验材料1.材料甘薯（IpomoeabatatasLam）叶片，品种为徐薯182.试剂①无RNA酶灭菌水：加入0.01%的DEPC，处理过夜后高压灭菌；②Trizol试剂；③氯仿；④异丙醇、75％乙醇；⑤TBE缓冲

4、液；⑥上样缓冲液（6×）3.仪器高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、1.5mL塑料离心管、枪头和EP管架四、实验方法1.将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物叶片加入1mLTrizol试剂，室温放置5min，使样品充分裂解；2.每1mLTrizol试剂加入200μL氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相；3.4℃12,000rpm离心15min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置1

5、5min；4.4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底；5.RNA沉淀中加入1mL75%的乙醇（用RNase-free水配制），温和震荡离心管，悬浮沉淀；4℃8,000rpm离心2min，弃上清；6.室温放置10min晾干沉淀；7.沉淀中加入20μLRNase-freeddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存；8.用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。23五、实验结果1.RNA提取结果依照Trizol 试剂盒方法，提出的RNA较少，此部分未以图或数据显示。2.R

6、NA后电泳结果如图1.其中9a为本组实验结果。由图可知RNA条带非常模糊，拖尾现象严重，几乎无法分清具体条带，亮度较大。点样孔附近的红色部分为杂质，在提取过程中并未很好除去。图1.RNA提取跑胶结果。其中1泳道为样品Marker，9a泳道为本小组RNA样品。与标准对照可见条带模糊，拖尾现象严重。六、分析与讨论1.RNA的提取产量并不多，可能是因裂解样品不充分或RNA沉淀未完全溶解所致。在实验过程中，由于对操作时间的掌握不熟练、操作技巧不完善，留上清与弃上清时令RNA损失了部分，使最终RNA产量不理想。2.R

7、NA电泳结果有EB存在时，电泳后28SrRNA和18S23rRNA在紫外灯下应看得很清楚，另出现条由tRNA，5.8SrRNA和5SrRNA组成的较模糊、迁移较快的带。如果RNA没有降解，则28SrRNA的亮度应为18SrRNA的2倍，且这两条带都无弥散现象发生。由图1.9a可知，RNA拖尾现象严重，说明RNA已大部分被降解；此外点样孔附近出现红色部分杂质，分析可能有并未除尽的蛋白质，同样影响RNA电泳结果。在进行实验时，本小组成员未严格戴上口罩并勤换手套，这可能使外源RNAase进入样品，导致其降解严重。

8、另外，提取出RNA后本小组未立即将样品放入-70℃保存，也为导致结果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分层的过程中，由于水相吸取过多，掺杂入部分蛋白质杂质而未于后续纯化步骤除尽，RNA条带拖尾严重可能还受该蛋白质影响。五、总结：本次试验RNA提取非常失败，从跑胶结果可见其降解严重。虽然大实验无法避免试剂交叉污染的可能性，且电泳用胶的质量也会影响实验结果，但从图1.2a，3a，2b等条带较为清晰的小组实验结果可