关于生物技术综合实验报告.doc

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1、关于生物技术综合实验报告生物技术综合实验 　　甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达 学生：学号： 同实验者： 　　谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH具有多种重要生理功能,抗自由基和抗氧化应激作用,保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶,可以调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用,说明γ-GCS也与植俐物抗逆过程密切相关。 实马验一甘薯叶片RNA提取疡 一、实验目的 1.了解真栓核生物RNA提取的原理液； 2.掌握Trizol额提取的方法和步骤。 二

2、、氧实验原理 　　Trizo廖l试剂是由苯酚和硫氰酸苯胍配制而成的单相的快速俄抽提总RNA的试剂，在水匀浆和裂解过程中，能在视破碎细胞、降解细胞其它诽成分的同时保持RNA的映完整性。TRIzol的光主要成分是苯酚。苯酚的鸯主要作用是裂解细胞，使痈细胞中的蛋白，核酸物质眯解聚得到释放。苯酚虽可淡有效地变性蛋白质，但不哺能完全抑制RNA酶活性掣，因此TRIzol中还底加入了8－羟基喹啉、异烤硫氰酸胍、β-巯基乙醇赵等来抑制内源和外源RN瑞ase。%的8－羟基喹蒙啉可以抑制RNase，争与氯仿联合使用可增强抑雁制作用。异硫氰酸胍属于卢解偶剂，是一类强力的蛋涛白质变性剂，可溶

3、解蛋白峙质并使蛋白质二级结构消页失，导致细胞结构降解，絮核蛋白迅速与核酸分离。脏β-巯基乙醇的主要作用斜是破坏RNase蛋白质园中的二硫键。在氯仿抽提喻、离心分离后，RNA处者于水相中，将水相转管后酣用异丙醇沉淀RNA。用咙这种方法得到的总RNA由中蛋白质和DNA污染很永少。 三、实验材料 1.材鸟料 甘薯叶片，品种为徐薯癣18 2.试剂 　　①无R循NA酶灭菌水：加入%的舌DEPC，处理过夜后高纬压灭菌； ②Trizol胰试剂； ③氯仿； ④异丙醇宦、75％乙醇； ⑤TBE书缓冲液； ⑥上样缓冲液 3散.仪器 　　高压灭菌锅、厘微量移液器、台式离心机氮、超净工作台、

4、电泳仪、择电泳槽、凝胶成像系统、烙塑料离心管、枪头和EP沃管架 四、实验方法 　　1浴.将叶片取出放入研钵中氨，加入适量液氮，迅速研宅磨成粉末，每50-10嚏0mg植物叶片加入1m荒LTrizol试剂，室制温放置5min，使样品厅充分裂解； 　　2.每1蛙mLTrizol试剂加咱入200μL氯仿，用手尧剧烈振荡混匀后室温放置沃3-5min使其自然分贼相； 　　3.4℃12,拎000rpm离心15m布in，吸取上层水相转移闸到新管中；在上清中加入鹿等体积冰冷的异丙醇，室孝温放置15min； 　　载4.4℃12,000r宴pm离心10min，弃既上清，RNA沉淀于管底界；

5、 　　5.RNA沉淀中艾加入1mL75%的乙醇写，温和震荡离心管，悬浮勋沉淀；4℃8,000r柏pm离心2min，弃上疆清； 6.室温放置10m橱in晾干沉淀； 　　7.徽沉淀中加入20μLRN葬ase-freeddH缺2O，轻弹管壁，以充分异溶解RNA，-70℃保共存； 　　8.用1%的琼甸脂糖凝胶电泳进行检测，兴用EB染色并照相。 五、谰实验结果 1.RNA提取纶结果 　　依照Trizo尹l试剂盒方法，提出的R颇NA较少，此部分未以图汲或数据显示。 2.RNA疑后电泳结果 　　如图1.睫其中9a为本组实验结果倪。由图可知RNA条带非职常模糊，拖尾现象严重，栗几乎无

6、法分清具体条带，榆亮度较大。点样孔附近的畅红色部分为杂质，在提取亦过程中并未很好除去。 　殃　图1.RNA提取跑胶蚌结果。其中1泳道为样品炼Marker，9a泳道衙为本小组RNA样品。与吁标准对照可见条带模糊，叁拖尾现象严重。 六、分析蕾与讨论 1.RNA的提取鞍 　　产量并不多，可能是尧因裂解样品不充分或RN巾A沉淀未完全溶解所致。趣在实验过程中，由于对操镍作时间的掌握不熟练、操悄作技巧不完善，留上清与绣弃上清时令RNA损失了垛部分，使最终RNA产量寓不理想。 2.RNA电泳经结果 　　有EB存在时，研电泳后28SrRNA和炸18SrRNA在紫外灯榨下应看得很清楚，

7、另出现感条由tRNA，rRNA映和5SrRNA组成的较惫模糊、迁移较快的带。如吊果 　　RNA没有降解，蓑则28SrRNA的亮度繁应为18SrRNA的2乐倍，且这两条带都无弥散白现象发生。由图1.9a娶可知，RNA拖尾现象严可重，说明RNA已大部分钝被降解；此外点样孔附近撅出现红色部分杂质，分析躇可能有并未除尽的蛋白质碟，同样影响RNA电泳结拍果。 　　在进行实验时，终本小组成员未严格戴上口认罩并勤换手套，这可能使鳞外源 　　RNAase进轩入样品，导致其降解严重辟。另外，提取出RNA后谗本小组未立即将样品放入幅-70℃保存，也为导致独结果不理想的重