生物技术实验报告

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1、组别：第六组组员：苏琳伟、陈治、陈家和、陈硅报告人：陈硅学号：10349069词汇&释义：Parafilm封口膜Chloroform氯仿（三氯甲烷）Isopropanol异丙醇DEPC焦碳酸二乙酯TRIZOLamono-phasicsolutionofphenolandguanidineisothiocyanatePhenol苯酚isthiocyanate异硫氰酸胍MCSmultiplecloningsite（polycloningsite）注：MSC是DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的

2、位置或插入方案。实验任务：1.从猪肌肉纤维中提取RNA;2.2对RNA上EGFP基因密码子片段进行RT-PCR扩增;3.将经RT-PCR技术扩增的cDNA与插入载体质粒，并将其转化入大肠杆菌进行克隆；4.从大肠杆菌中提取含目的基因的载体质粒。实验目的:1.掌握提取纯化总RNA的原理和技术；2.掌握RT-PCR原理和技术；3.掌握TA克隆原理和技术。实验原理：A．总RNA提取和纯化RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无R

3、NA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，是一种由苯酚和异硫氰酸胍组成的单相溶液它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能

4、相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。无论是人、动物、植物还是细菌组织，各种样品最大使用量（1mlTrizol），动物组织(50mg)，植物组织(100mg)，丝状真菌(100mg)，动物细胞(5×106～1×107)，酵母(1×107)。TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7kb和15kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势

5、核糖体RNA条带位于~5kb(28S)和~2kb(18S)，低分子量RNA介于0.1和0.3kb之间(tRNA,5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8。Rnase污染的10大来源1：手指头2：枪头3：水/缓冲液4：实验台面5：内源Rnase6：RNA样品7：质粒抽提8：RNA保存9：阳离子(Ca,Mg)10：后续实验所用的酶RNA提取须杜绝外源酶的污染，实验时应注意一．严格戴好口罩，手套。二．实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。三．实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-

6、Free。RNA纯化流程图（附：上清不含DNA的原因：1.因为细胞中存在DNA酶，在提取之前细胞破碎的时候没有加DNA酶抑制剂，DNA已经被分解了。2.上层水相，PH5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，DNA就会溶解在水相，（导致PH中性的大概原因是trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量）RNA纯化要求1纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2排除有机溶剂和金属离子的污染3蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4排除DN

7、A分子的污染B．RT-PCR一、知识背景：1、基因表达：DNARNAProtein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。2、PCR技术(olymerasechainreaction)：即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：a、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链

8、DNA；b、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。c、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘3’