高赖氨酸转基因玉米植株的再生与检测

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1、华中农业大学硕士学位论文高赖氨酸转基因玉米植株的再生与检测姓名：王学永申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：番兴明20120620高赖氨酸转基因玉米植株的再生与检测摘要玉米是我国第一大作物，不仅是重要的粮食来源，而且还是重要的饲料、工业原料。统计表明，我国80％以上的玉米主要用作饲料，但是由于普通玉米的营养品质较差，缺乏人体及单胃动物生长发育必需的赖氨酸，色氨酸等，在作为饲料时必须添加赖氨酸等物质才能满足畜禽生长发育的需要，因此，发展高赖氨酸优质功能型玉米不仅可以促进我国畜牧业和相关饲料加工业的快速发展，而且

2、对解决我国部分人群的营养不良问题也具有重要的意义。对opaque．2基因的成功利用大大加速了优质蛋白玉米育种的进程，但是其隐性遗传和影响胚乳硬度的特点严重影响了育种效率。在这种情况下，通过基因工程技术降低或沉默玉米籽粒胚乳中醇溶蛋白基因家族的表达，以此提高其他富含赖氨酸蛋白质含量从而达到提高玉米胚乳中总赖氨酸含量的目的已经得到证实。因此我们在前人的研究基础上，构建了玉米22．KD醇溶蛋白基因干涉载体，采用基因枪轰击的方法转化玉米幼胚愈伤组织，取得如下进展：1、将含有玉米醇溶蛋白基因目标序列的干涉基因(22．KD)与B

3、ar基因按3：1的比例混合，通过基因枪轰击玉米H99×HiBFl代胚性愈伤组织，每个干涉基因构建的载体轰击200枪，分化幼胚数为3356个。通过bar基因的抗性筛选，得到90个分化幼苗，To代PCR检测得到的阳性独立事件数为60个，但由于转基因植株生活力较差，最终可以正常生长收获的转基因事件数为9个。2、通过PCR跟踪鉴定，T1代22．KD获得阳性转基因植株44株。3、近红外谷物品质分析仪对22．KDT1代转基因阳性株系的籽粒进行赖氨酸含量检测结果表明，转22．KD干涉基因的阳性株系中有3个株系赖氨酸含量低于对照，4

4、个株系的赖氨酸含量提高了5．2％．23．4％，2个株系的赖氨酸含量达到了优质蛋白玉米的标准(O．419和0．468)，分别比对照提高了46．5％和63．6％。4、利用SAS—PAGE蛋白质电泳对22．KDT1代转基因阳性株系的籽粒进行醇溶蛋白检测，结果表明，转22一KID干涉基因的阳性籽粒的22．KDa．醇溶蛋白与非QPM材料B73、云瑞21和阴性对照相比下降明显，表明22．KD干涉基因抑制了22．KD基因家族的表达。虽然RNAi干涉已经是一项比较成熟的进行基因改良和种质创新的现代分子技华中农业大学2012届硕士研究

5、生学位论文术，我们的试验也得到了不错的进展和结果，但是由于本试验目前的转基因株系代数还比较低，遗传还不稳定及遗传背景还比较复杂等原因，得到的结果还需要更多的试验进一步的验证。关键词：优质蛋白玉米；RNAi；转基因；SAS．PAGE蛋白质电泳高赖氨酸转基因玉米植株的再生与检测ABSTRACTMaize，thelargestcropinChina，isnotonlyanimportantsourceoffood，butalsoanimportantfeedandindustrialrawmaterials．Statist

6、icsshowedthatmorethan80percentofmaizeismainlyusedforfeed．However,duetothepoornutritionalqualityofnormalmaizewhichlacksofessentialaminoacidssuchaslysineandtryptophanwhicharenecessaryforhumanandmonogastricanimals’health，additiveslikelysineandothersubstancesmustbe

7、suppliedintofeed．Therefore，breedhighlysinecontentmaizehasgreatsignificancenotonlyinpromotingthedevelopmentofthefeedandstockindustry,butalsocaneasethemalnutritionprobleminpartofChina．Thesuccessfuluseoftheopaque-2genegreatlyacceleratedtheprocessofqualityproteinma

8、izebreeding，butthecharacteristicsofrecessiveinheritanceandendospermhardnessseriouslyaffectedthebreedingefficiency．Previousstudiesalreadyprovedthatusinggeneticengineeringtech