高赖氨酸蛋白基因sb401玉米转基因植株的获得及检测分析

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1、郑州大学硕士学位论文高赖氨酸蛋白基因sb401玉米转基因植株的获得及检测分析姓名：孙静申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：田保明；铁双贵201205摘要玉米是全世界最重要的粮食、饲料和经济兼用作物，但是玉米中赖氨酸的含量偏低，每百克含赖氨酸仅2．59左右，而赖氨酸是人和畜禽必须的营养，这样导致玉米中蛋白质的利用率很低。增加玉米中蛋白质和赖氨酸含量，促进人和动物对其蛋白质的消化吸收，将提高玉米的利用价值。传统的育种方法在一定程度上提高了赖氨酸的含量，但是提高的潜力不大，费时费力。现代分子生物学和生物技术的迅速发展为使用基因工程技术手段来实现玉米品质的改良

2、带来了希望。相对于其它转化方法来说，农杆菌介导法具有能够转移相对较大的DNA片段、外源基因单拷贝或低拷贝整合、不易引起分子间或分子内重排、转化效率高等优点，但是其转化效率又受到受体材料、菌液浓度和培养基成分等多种因素的限制，因此建立一套完整的、高效的遗传转化体系是非常重要的。本研究利用农杆菌介导法将含有从马铃薯花粉中克隆出的高赖氨酸蛋白基因sb401和标记基因bar的植物表达载体转到玉米杂交组合HiIIA×B中。所用的农杆菌菌株为EHAl05，转化材料为由HiIIAXB的幼胚诱导出的愈伤组织，利用优化后的转化系统，确定农杆菌的悬浮浓度OD600为0．伽．8，侵染

3、时问为5min，侵染后的愈伤组织共培养时间为3--4d。第一轮筛选所用双丙胺膦浓度为1．5mg／L，以后筛选浓度均为3mg／L，共筛选3~4轮。经双丙胺膦筛选后得到70株转化植株，PCR检测发现有15株呈刚性。随机选取4株PCR呈阳性的植株进行PCR．southern检测，杂交结果呈阳性，证明外源基因已经整合到玉米基因组中。用Bar蛋白快速检测试纸条检测发现试纸条呈阳性，证明bar蛋白已经得到表达。用PCR和PPT涂抹法检测Tl代植株的阳性率为23．2％，证明高赖氨酸蛋白基因sb401已经得到稳定的遗传。关键词玉米；转基因；高赖氨酸蛋白基因；农杆菌介导法Abst

4、actAbstractMaizeisthemostimportantgrain，feedandeconomyapplicablecrop，butinthelowcontentofcomlysine，everygramonlycontaimngabout2．59lysine，evenlysinetOman，livestockandpoultryisamust，whichhascausedtheutilizationrateoftheproteinsintheCOITIisverylow．Increasingproteinandlysinecontentincom，

5、promotingtherateofdigestionandabsorptionofmanandanimaltothecomproteinwillimprovethevalueofcorn．Thetraditionalmethodsofbreeding，tosomeextent，haspromotedthecontentoflysine，buttIlepotentialofthemethodsisnotbigandtime-consuming．ItishopedthatimprovingthequalityoftheCOlalwillberealizedbyth

6、emethodsofgeneticengineeringtechnologywiththerapiddevelopmentofmodemmolecularbiologyandbiologicaltechnology．TheAgrobacterium·mediatedtransgenicmethodhasmanyadvantagesoverothergenetransformationmethods，forexample，transferringarelativelylargesegmentsofDNA，highfrequencyofsingleorlowcopy

7、insertionevents，noteasycausingrearrangementwithinmoleculesorintermolecular，hightransformationefficiency，eta1．Itstransformationefficiencywaslimitedbymaterials，bacterialiquidconcentration，mediumcompositionandmanyotherfactors．Soestablishingacompleteandefficientgenetictransformationsyste

8、misveryimpor