青蒿琥酯抗骨髓增生异常综合征作用和机制的体外实验研究

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1、河北医科大学博士学位论文青蒿琥酯抗骨髓增生异常综合征作用和机制的体外实验研究姓名：王颖申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：潘崚201204中文摘要青蒿琥酯抗骨髓增生异常综合征作用和机制的体外实验研究摘要目的：骨髓增生异常综合症(myelodysplasticsyndrome，MDS)是一组以骨髓无效造血和具有向AML转化倾向为特征的异质性强的恶性克隆性疾病，发病以老年人多见，无法承受强烈化疗和骨髓移植治疗，治疗相当棘手而疗效却很有限。目前仍为不可治愈的恶性血液病。高危MDS治疗效果差，多数患者不得

2、不依赖输血生存，并最终转化为AML而死亡，预后极差。因此有必要寻找效果好骨髓抑制轻且经济的新药物来改善中高危MDS患者的预后。青蒿琥酯(artesunate，ART)是自中药青蒿中提取的青蒿素的半合成衍生物。是一种安全有效的抗疟药。近年来发现其通过促进多种肿瘤细胞分化和程序性死亡，抑制肿瘤细胞增殖来抑制肿瘤。低浓度对正常细胞无明显细胞毒作用，高浓度时在动物实验发现有胚胎毒性、可逆性肾损伤和骨发育异常。高危MDS的特点是骨髓细胞高度增生，但存在无效造血而导致外周血三系减少，MDS的骨髓基质细胞异常导致化

3、疗和移植后恢复慢，风险高。不能施行移植的高危MDS患者的治疗更需要寻找一种经济而安全有效的药物，以改善患者的生存质量。近几年FDA批准的用于MDS治疗的去甲基化药物5．氮杂胞苷(5-aza．cytidine，Aza)和5．氮杂．2’．脱氧胞苷(5-aza．2’一deoxycitidine，DAC)，一方面由于非靶向的细胞毒作用、潜在的致癌性、临床应用后耐药病例的出现以及昂贵的治疗费用，另一方面虽然改善输血依赖有效率达50％，但是较低的总反应率(10％．20％)，限制了其在MDS的治疗应用。青蒿琥酯多年

4、来用于抗疟治疗安全而有效，不良反应轻微，未见引起骨髓抑制的报道。青蒿琥酯对高危MDS细胞是否有治疗作用，目前国内外也未见相关研究。因此我们以高危MDS细胞系SKM．1细胞和原代MDS细胞为研究对象。观察ART能否诱导高危MDS细胞的凋亡，并探索凋亡的分子机制。近来临床和实验研究显示表观遗传学异常在MDS发病和向白血病转化过程中起到关键作用，是临床治疗MDS很具前景的靶位。发挥异常甲基化状态维持作用的DNMTl在AML和MDS中转录水平明显高于正常中文摘要[261，同时也是备受关注的表观遗传学治疗靶位。

5、鉴于表观遗传学变化在MDS发生发展中的重要作用，在前期研究基础上从表观遗传学调节基因的角度来探讨ART作用于MDS细胞的机制，为ART用于高危MDS的治疗提供体外实验依据。方法：lCCK．8细胞活力实验检测ART处理后SKM．1细胞的活力，设空白对照、溶剂对照、Trolox预处理组及Ac．DEVD．CHO预处理组。检测正常对照骨髓单个核细胞、基质细胞、高危MDS患者的原代细胞和MDS转化的AML患者的原代细胞经ART处理前后的活力变化。DAC与ART联用的细胞活力实验采用析因设计进行试验，联用效应应用

6、联用指数(CI)来评价。2瑞氏．吉姆萨染色观察10pmol／L的ART处理24h后的SKM．1细胞和MDS原代幼稚细胞的形态学变化。3PI染色检测ART处理SKM．1细胞24h后细胞周期的变化和亚二倍体峰的有无。4JC．1阳离子脂质荧光染料染色检测用终浓度分别为l、5、109mol／L的ART处理1h后的SKM。l细胞MMP变化，和109mol／L的ART处理O．5、1、3、6、12、24h后的SKM．1细胞MMP变化。5蛋白印迹(WB)检测终浓度为1、5、109mol／L的ART处理SKM．1细胞6

7、h后caspase．8、caspase．9、活性的caspase3、PAI冲、bid、AIF的表达。检测凋亡调节蛋白BCL．2、bax、bad、P．bad、survivin、XIAP。检测SKM．1细胞生存通路P13到AKT主要信号蛋白Pten、Akt、P．Akt(Ser473)和P．Akt(Thr308)的变化。第二部分研究中，收集l、5、109mol／L的ART作用6h后和10“rnol／L的ART处理3h、6h、12h后的SKM．1细胞，以未加ART组作空白对照，检测DNMTl蛋白水平的变化。6

8、Fluo．3．Am荧光探针检测10¨mol／L的ART处理O．5、l、3h后的SKM．1细胞内的钙离子浓度的变化。7DCFH．DA荧光探针检测109mol／L的ART处理O．5、3、6、12、24h后的SKM．1细胞内活性氧簇的变化。8细胞免疫荧光染色观察SKM．1细胞在109mol／L的ART处理6h后是否存在AIF核内转位。中文摘要9RT．PCR检测DNMTlmRNA变化。分组收集1、5、109mol／L的ART作用6h后和10lamol／L的ART