沙门氏菌脂肪酸分型的研究及快速诊断方法的建立

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1、河北医科大学硕士学位论文沙门氏菌脂肪酸分型的研究及快速诊断方法的建立姓名：宋红梅申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：金玉怀20090301中文摘要沙门氏菌脂肪酸分型的研究及快速诊断方法的建立摘要目的：沙门氏菌是国际公认的危害最严重的食源性致病菌。传统的沙门氏菌检测方法操作繁琐，通常需时4～7天；在流行病学诊断中常用的沙门氏菌分子生物学分型方法，要在获得可疑爆发菌株纯培养物的基础上进行，不仅消耗大，需时也较长，难以满足食物中毒快速诊断及有效防控的需要。脂肪酸分型方法将甲基脂肪酸提取与灵敏的气相色谱检测法结合，通过分析微生物细胞膜上的磷脂脂肪酸的组成，来鉴定微生物的种属、

2、分析微生物的多样性。基于此原理开发的微生物鉴定自动化系统SherlockMIS可比传统方法最少提前24h出具鉴定结果，获得的数据可直接应用系统附带的软件进行基于菌株脂肪酸成分的聚类分析，大大缩短流行病学诊断所需时间，且操作简便，特别适用于大通量标本的分析。但是，现有的Sherlock数据库中仅包含五种血清型沙门氏菌的脂肪酸数据，尤其是不包括我国流行的沙门氏菌脂肪酸成分的基础资料，使得该系统在我国的应用受到一定的限制。本研究选择2005年-2007年河北省17个血清型的130株沙门氏菌分离株进行脂肪酸分型研究，目的是建立适合我国沙门氏菌脂肪酸分型快速诊断的实验条件和方法，探讨我

3、国沙门氏菌流行株的脂肪酸构成特征，在提供我国沙门氏菌脂肪酸组成中文摘要本底资料基础上，补充和完善沙门氏菌脂肪酸数据库，为在我国应用SherlockMIS进行沙门氏菌快速诊断提供依据。方法：1．沙门氏菌脂肪酸分型快速诊断方法的建立：将猪霍乱沙门氏菌标准株分别在TSBA培养基28℃培养24h和TSA培养基+5％去纤维绵羊血35℃培养24h两种条件下培养，提取脂肪酸进行鉴定，分别与TSBA6和CLIN6数据库匹配。另在培养条件固定前提下设置25mg--一35mg、35mg～45mg、45mg--。55mg三个取菌量组，分别在不同获菌量条件下对猪霍乱标准株进行脂肪酸提取和鉴定。实验各

4、重复十次，确立沙门氏菌脂肪酸分型鉴定的最佳培养条件及最佳获菌量范围。应用建立的方法对130株沙门氏菌及130株非沙门氏菌进行脂肪酸分型鉴定，评价方法的准确性、特异性、重复性。2．沙门氏菌脂肪酸分型研究：应用建立的方法对2005年～2007年河北省17个血清型的130株沙门氏菌分离株进行脂肪酸组成及含量分析，提供我国沙门氏菌流行株特征脂肪酸组成数据，评价脂肪酸分型方法对沙门氏菌的分型能力。3．脂肪酸分型与脉冲场凝胶电泳分型(PFGE)方法在食物中毒流行病学诊断上的应用比较：同时应用两种分型方法对17株分离于一起沙门氏菌食物中毒的可疑爆发株及lO株非相关的沙门氏菌分离株进行菌株同

5、源性分析。比较方法间优劣，探讨脂肪酸分型方法在流行病学诊中文摘要断上的应用前景。结果：应用TSBA培养基进行细菌的分离培养和控制获菌量为40mg，进行沙门氏菌脂肪酸分型，对沙门氏菌鉴定的准确性达92．3％，特异性为100％，重复性为90％。以此作为标准参考方法对17个血清型的130株沙门氏菌分离株进行脂肪酸分析，共得到19种不同脂肪酸成分，其中所有菌株都含有的脂肪酸成分有12种，占优势的脂肪酸成分为：12：0、14：0、16：0、17：0cyclo、SumlnFeature2、SumlnFeature3，SumlnFeature8，较Sherlock数据库多了14：020H、

6、17：0、18：0、18：1c09c。不同血清型沙门氏菌共有脂肪酸成分非常接近，仅有1～2种脂肪酸成分的差异。本次检测的肠炎沙门菌分离株具有另外四种共有成分13：0、16：1c05c、14：020H、18：10D9c；猪霍乱沙门菌具有另外两种共有成分16：1c05c、18：1t09c，而缺少了19：0iso。本实验中肠炎沙门菌17：0含量低于数据库数据，而18：0含量远高于库中值；猪霍乱沙门菌17：0cyclo含量远低于数据库数值，而18：0含量高于库中值。同时运用PFGE和脂肪酸分型方法进行菌株同源性分析结果显示，在小样本暴发资料的研究中脂肪酸分型方法能够反映菌株之间的亲缘

7、关系，聚类结果与脉冲场分型总体一致。但在菌株同源性判断的精确性上与细菌分型“金标准”PFGE还有差距。结论：1．优化了细菌脂肪酸分析分型的实验条件，建立了沙门氏菌脂肪酸分型标准参考方法。使用TSBA培养基，中文摘要28。C培养24h，控制获菌量在40mg(35---一45mg)，获得的沙门氏菌的脂肪酸数据与Sherlock数据库匹配最佳，鉴定结果最准确。在此基础上建立的沙门氏菌脂肪酸分型快速诊断方法可通过单次实验较准确地将沙门氏菌鉴定到种。2．提供了我国沙门氏菌流行株脂肪酸组成本底资料，补充和完善了Sh