血管抑素抑制兔角膜碱烧伤后新生血管的蛋白组研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文血管抑素抑制兔角膜碱烧伤后新生血管的蛋白组研究Proteomicanalysisrevealseightcandidatesrespondingfor．●●一。’‘·no●’ant卜anglogenesls0l=localadministrationolangnostatlnIortreatingalkaliinducedrabbitcornealneovascularization课题来源：广东省自然科学基金项目专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员眼科学封亮旗刘海俊于强陆晓和朱斯平吴京杨小红论文评阅人郭海科陈剑

2、2012年04月15日广州硕士学位论文血管抑素抑制兔角膜碱烧伤后新生血管的蛋白组研究硕士研究生：封亮旗指导老师：刘海俊摘要1．研究目的及意义角膜组织没有血管的透明组织。维持其透明性的一个很重要的原因是它没有血管。在感染、外伤、免疫反应、排斥反应、佩戴角膜接触镜、碱烧伤、基质溃疡、角膜缘干细胞病变等病理情况下，从角膜缘血管网形成的新生血管逐渐侵入角膜，从而形成角膜新生血管(cornealneovascularization，CNV)。诚然，CNV在感染清除、伤口愈合等方面具有一定的积极作用。但是，CNV导致角膜的透明性降低，从而严重的影响视力，另外，CNV可破坏角膜

3、正常微环境，使眼前节生理性的免疫豁免消失，因而成为角膜移植排斥反应的高危因素。因此，针对角膜新生血管的治疗业已成为眼科的研究热点。近年来的研究证实，血管抑素(angiostatin，AS)存在着明确的抗角膜新生血管形成的作用，角膜上皮细胞被证明可以分泌血管抑素，但在角膜受到损伤后分泌减少。另外，血管抑素被证实通过病毒载体或者局部运用可以抑制角膜新生血管形成。但相关作用机制研究的不足，影响着其最终运用于临床的进程。因此，阐明血管抑素抗角膜新生血管形成的机制，势必为其临床运用奠定坚实的基础，并产生巨大的社会和经济效益。2．研究方法众所周知，蛋白质是一类重要的生物大分子

4、，是生命活动的主要承担者。摘要在蛋白质组(proteome)概念提出以后，蛋白质组学的研究取得了可喜的发展。相比较传统的只针对单一蛋白质的研究，蛋白质组学更加注重的是参与特定生理或病理状态的所有蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。随着相关实验技术的发展，目前已有可能对细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，相关蛋白质的分类和鉴定，尤其是蛋白质之间相互作用和蛋白质的功能进行探讨。因此，本课题拟以碱烧伤制备的角膜新生血管为基础，局部施加血管抑素，将角膜组织进行二维电泳，分离蛋白质并进行染色，凝胶图像分析系统对蛋白质点进行定量分析，从而明确局部施加血管抑素在抗角

5、膜新生血管形成过程中的差异表达蛋白，进一步地，对其进行质谱分析，从而得到相关蛋白质的定性数据。3．研究内容和过程(1)实验动物及分组：本实验采用的是32只新西兰大白兔(购自南方医科大学动物中心)，实验动物分为三组，A组为空白对照组：8只新西兰兔不做任何处理；B组为烧伤组：12只新西兰兔采用碱烧伤的方法建立角膜新生血管模型，术后第1天开始局部生理盐水点眼，每日3次，直至取角膜标本；C组为治疗组：12只新西兰兔采用同样方法建立角膜新生血管模型后，术后第1天开始局部用3099／ml血管抑素(AS)点眼，每日3次，直至取角膜标本。(2)角膜新生血管模型制作：碱烧伤法制备角

6、膜新生血管模型：氯胺酮25mg／kg及氯丙嗪25mg／kg肌注新西兰兔全身麻醉，O．5％丁卡因表面麻醉，置开睑器充分暴露眼表，将浸有1．5mol／LNaOH液的10mm圆形滤纸片置于眼表中央，1．5min后取下，用50ml生理盐水冲洗眼表，滴妥布霉素眼液后涂妥布霉素眼膏。(3)角膜新生血管的观察：术后观察角膜的新生血管，第16曰使用裂隙灯(苏州66生产YZ5T型号)照相。角膜新生血管的检测：测量血管长度，以连续弯曲度小、新生血管朝向角膜混浊中心生长的最长血管为准，并计算角膜新生血管生长面积(A)，按公式A=C／12x3．1416[1上．(r．1)2]。C为Nv累及

7、角膜的圆周钟点数，l为新生血管从角膜缘深入角膜的长度，r为兔角膜半径，设为硕士学位论文定值7mm。(4)标本取材及全蛋白提取：术后3w取材。标本离体后迅速置入5ml冻存管，于液氮速冻后置入一80℃超低温冰箱保存备用。取一80℃保存的组织块，迅速研磨至细粉末状，加入裂解液匀浆、离心。采用Bradford定量法，计算样品蛋白质浓度。(6)双向凝胶电泳(2．DE)：第一向(IPG．IEF)根据蛋白质等电点的不同进行等电聚焦，第二向(SDSPAGE)根据蛋白质相对分子质量大小分离样品，双向电泳后才用EMBL银染。(7)图像分析和差异蛋白选取：将银染后的2-DE胶图扫描入电

8、脑。应用I