血管内皮生长因子对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的影响

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1、重庆医科大学硕士学位论文血管内皮生长因子对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的影响姓名：赵霞申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：张晓刚201205血管内皮生长因子对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的影响摘要目的观察血管内皮生长因子(vEGF)对小鼠诱导多能干细胞(觚PSc)向心肌细胞分化的影响。方法在白血病抑制因子(LIF)和成纤维细胞存在的条件下培养小鼠iPSc，从小鼠iPSc的镜下形态特征，干细胞基因Oct一4的表达及iPSc的碱性磷酸酶染色方面鉴定iPSc。并采用悬滴培养法启动iPSc分化，分别以10ng／“、20ng／ml、50ng／m

2、1的VEGF作为诱导剂对小鼠iPSc诱导分化，以自然分化作为阴性对照组，以加入1％二甲亚砜(DMSO)诱导剂作为阳性对照组。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，记录各组跳动的拟胚体(EBs)出现的具体时间及每天跳动的拟胚体的数目，进一步计算心肌细胞分化率。PT-PCR检测分化过程中心肌发育基因a—MHC和13．MHCI出NA的表达，细胞免疫荧光检测iPSc分化细胞cTnT的表达。结果1．在LIF和成纤维细胞存在的条件下，iPSc呈集落样或巢状生长且不断增殖；荧光显微镜下小鼠iPSc呈绿色荧光(Oct一4启动)，碱性磷酸酶染色提示iPSc细

3、胞团着紫黑色。2．各分化组均可在光镜下见白发搏动的EBs，与自然分化组相比，三个浓度组的VEGF均可提高iPSc的心肌细胞分化率(PO．05)。3．各分化组分化而来的细胞均表达调控心肌发育的基因a—MHC和13-MHC；VEGF可上调a—MHC和13．MHC的表达，VEGF浓度为20ng／ml时，其上调作用最为明显(P<0．05)。4．

4、各分化组分化而来的心肌细胞可白发搏动，同时表达心肌特异蛋白cTnT。结论1．在LIF和成纤维细胞的环境中，小鼠iPsc保持未分化状态，去除这两者后，小鼠iPSc可以通过形成拟胚体开始分化。2．一定浓度的外源性的VEGF可以促进诱导多能干细胞向心肌细胞的分化。关键词血管内皮生长因子；小鼠诱导多能干细胞；分化；心肌细胞THEEFFECToFVASCULARENDOTHELIALGRoWTHEACToRoNDIFFERENTIATIONOFMOUSEINDUCEDPLURIPOTENTSTEMCELLSINToCARDIoTⅥYOCYTESAB

5、STRACTobjectiVeT0observethce虢ctofVascularendothelialgrowthfacto“VEGF)ondi妇FeremiationofmouseiIlducedpluripotentstemcells(iPScells)intocardioInyoc”es．MethodsMouseiPScellswereculturedonnlouseemb巧oIlic助roblast(MEF)withmediumcontainingleukemiainllibito叫factor(LIF)．Undi任．erent

6、iatedmouseiPScellswereidentifiedbytheirmo印hologyunderIIlicroscope，expressionofgreennllorescentprotein(GFP)promotedbystemceUgenes0ct一4andalkalinephosphatasestaillillg．Hangingdropmethodwasusedtomal(eiPScellsdi归融rentiate．1On∥m1，20ng／ml，50n∥mlVEGFwererespectiVelyaddedtoinduce

7、thedi自凫relltiationofiPSceUs．Naturaldi虢rentiationwithoutanyiIlducerwasnegativegroupand1％dimethylsulf．oxide(DMSO)wasaddedaspositivecon旺ol黟oup．Cellswereobservedunder血croscope，thetimeofbeatillgembWonicbodies(EBs)appearedandnumbersineachgroupwererecordedandmedia、erentiationrat

8、eofInyocardialcellswascalculated．Theexpressionof仅一MHCandp—MHCmRNAindi妇睹rentiatedcellsweredetecte