白蛋白纳米粒的胞吞作用研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文白蛋白纳米粒的胞吞作用研究UptakeofAlbumNanoparticlesbyCells课题来源：2010年度南方医院院长基金资助(NO：20108018)广东省药学会医院药学研究基金资助(NO：2010A06)专业名称学位申请入指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员药剂学金召英杨西晓程国华教授方永奇教授陶涛教授吴青业教授王春霞教授论文评阅人季爱民教授金伟军教授2012年5月2日广州硕士学位论文mlI

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12、帅lY2257506白蛋白纳米粒的胞吞作用研究研究生：金召英指导教师：杨西晓摘要研究

13、背景纳米给药系统若要发挥疗效，不仅要在靶部位浓集，还需保证将药物递送到胞内的作用靶点。虽然避免调理素和脂蛋白的作用及被巨噬细胞吞噬是药物靶向的重要条件，但是如果纳米给药系统不能以合理的方式到达细胞内的靶部位，并且有效释放药物，同样不能发挥很好的疗效。靶向纳米颗粒到达靶组织／靶器官后可在胞外释放药物，使药物以游离方式入胞或携带药物直接进入细胞，在胞内靶点适时地释放药物。前一种传递方式的关键在于给药系统的释放药物特性，胞外药物释放行为决定了最终的药效发挥。而后者给药系统的入胞过程涉及入胞方式、胞内转运、药物的胞内释放、细胞外排等复杂的细胞处置过程，也是药剂学领域备受

14、关注且极具挑战的研究内容。大多细胞主要以内吞的方式对外源性纳米粒子进行摄取，而内吞主要分为网格蛋白介导的内吞(clathrin．mediatedendocytosis)、细胞膜穴样凹陷介导的内吞(caveolae．．mediatedcndocytosis)、大胞饮和非网格蛋白．细胞膜穴样凹陷依赖的4种内吞。而几年来备受关注的细胞膜穴样凹陷介导的内吞是将载体递送至pH条件和生物条件缓和的小窝体(cavcosome)内然后被转运到内质网、高尔基体和胞浆中，避免了经典的内体／溶酶体转运中文摘要体系。以网格蛋白介导内吞最为常见。纳米颗粒入胞后进入内体，进一步与溶酶体融合

15、，这对非溶酶体靶向的药物不利。微粒种类、表面电荷、物化性质等因素都会影响甚至改变细胞的内吞途径，改变纳米给药系统在胞内的分布和在溶酶体中的转运过程，从而影响胞内靶点处的药物浓度。同时，细胞内吞效率、细胞消除、胞内药物释放也受载体因素的影响。结合实验内容与预实验结果，我们将钙黄绿素作为水溶性小分子药物模型，制备了钙黄绿素白蛋白纳米粒，考察了纳米粒包裹对其细胞摄取及内化途径的影响。研究目的制备白蛋白纳米粒，并进一步研究其胞吞机理。研究方法1．制备方法与表征用去溶剂化和乳化凝聚法制备钙黄绿素白蛋白纳米粒，并确定最佳处方和工艺条件。去溶剂化：先将白蛋白加入含有药物的稀水

16、溶液中使之溶解，再加入有机溶剂使白蛋白脱水凝聚收缩成团粒，最后用甲醛或戊二醛作为交联剂固化成载药纳米粒。乳化凝聚法：①乳化。将药物与白蛋白一起溶解或分散于水中作为水相，将其加入搅拌着的油相中使之称为w／o型乳液。②固化。可以采用加热固化或用化学交联剂使白蛋白之间发生交联反应而固化，常用甲醛或戊二醛为化学交联剂。③分离。将形成的纳米粒加入乙醚溶解油相，离心分离，即得。纳米粒胶体溶液在长期储存过程中粒子会发生聚集和沉降现象，并有部分药物游离出来。因此，将纳米粒制成冻干粉针以提高制剂的稳定性。用透射电镜对纳米粒的形状和表面形态进行考察，并用粒径分析仪对粒径分布进行统计

17、。采用动态透析法做体外释放研究。稳定性实验：将最佳处方的钙黄绿素白蛋白纳米粒冻干制剂于冰箱中4"C密封保存，分别于3个Ⅱ硕士学位论文月、6个月、9个月和12个月测定纳米粒的外观、再分散性，考察其长期稳定性。采用经典的MTT法检测白蛋白纳米粒的细胞毒性，注射用盐酸阿霉素为阳性对照组。lmg·mL4的药物溶液与细胞孵育48h后，通过多功能酶标仪测定细胞活力考察calceinHSA．NPs的细胞毒性。2．纳米粒胞吞机理研究本文采用多功能酶标仪在Lex=470nm，kem=509nm处检测不同时间点时的细胞裂解液的荧光强度，激光共聚焦显微镜和荧光显微镜观察细胞摄取、胞内

18、分布。对于细胞摄取机制的考察，细胞以1×106个／孔接种至6孔板上，待完全贴壁生长24h后，弃去培养液换成含细胞内吞抑制剂叠氮钠(NaN3)，2．去氧葡萄糖(2DG)，氯丙嗪(CPZ)，非律平(Filipin)，细胞松弛素D，蔗糖(Sucrose)的培养液，与细胞孵育30min后加入1mg·mLd载钙黄绿素的纳米粒，继续培养1h。然后以PBS洗涤，胰酶消化后收集细胞，PBS洗涤3次，流式细胞仪检测其平均荧光强度，透射电镜观察细胞摄取的超薄切片。最后我们用荧光显微镜观察CalceinHSA-NPs对细胞F．Aetin蛋白的影响。研究结果1．制备方法与表征采用去溶剂

19、化法制备钙黄绿素白蛋白纳