白头翁质量评价与五环三萜皂苷类成分的药物代谢动力学研究

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1、河北医科大学博士学位论文白头翁质量评价与五环三萜皂苷类成分的药物代谢动力学研究姓名：许慧君申请学位级别：博士专业：药理学指导教师：张兰桐201204中文摘要白头翁质量评价与五环三萜皂苷类成分的药物代谢动力学研究摘要白头翁(尸甜厶口巧耽chinensis(Bunge)Regel)是毛莨科植物白头翁的干燥根【31，主要分布于亚洲、欧洲和北美洲等地区。白头翁具有清热解毒、凉血止痢的功效，临床上被广泛用于阿米巴性痢疾、疟疾、阴道滴虫、细菌感染和恶性肿瘤等疾病的治疗。近年来，由于白头翁药材具有明显的抗肿瘤⋯1】作用而越来越被广泛关注。故本课题对白头翁药材进行了

2、系统地分离、质量评价和药物代谢动力学研究。本实验采用大孔吸附树脂法，硅胶柱色谱法、葡聚糖凝胶和反相柱色谱法对白头翁药材进行系统分离，并建立了一个简单、快速的HPLC．ESI．MS法同时定量测定白头翁药材中9种化学成分。在对其进行定性研究中，利用I-IPLC．ESI．MS／MS联用技术分析研究了8个五环三萜皂苷类化合物的特征碎片离子，推测其电喷雾质谱裂解规律，最终在白头翁提取物中推导出了37个五环三萜皂苷化合物的结构。在药代动力学研究中，首次建立了一种灵敏的、可靠的多次切换监测模式HPLC—MS方法同时测定大鼠灌胃给予白头翁提取物后大鼠血浆中4种三萜皂

3、苷的含量，并应用于药代动力学研究。首次对大鼠口服白头翁提取物后胆汁中6种五环三萜皂苷类化合物进行分析测定，并对这些三萜皂苷的胆汁排泄轮廓进行研究。综上对白头翁药材的系统研究将为其进一步开发应用提供全面的理论依据。第一部分白头翁化学成分研究目的：研究药材白头翁(Pulsatillachinensis(Bunge)Regel)中的化学成分。方法：取粉碎后的白头翁约10kg，用70％乙醇冷浸提取3次，采用AB．8大孔吸附树脂进行分离，收集70％乙醇洗脱液部分，得浸膏(总苷)约500g。采用大孔吸附树脂法，硅胶柱色谱法、葡聚糖凝胶和反相柱色谱法对白头翁药材进

4、行系统分离，并用波谱和化学方法鉴定化合物的结构。中文摘要结果：从白头翁的70％乙醇提取物中分离得到9个单体化合物，对其进行了结构鉴定，其中包括5个五环三萜皂苷，2个三萜酸，2个甾酮类化合物。分别鉴定为齐墩果酸、白头翁皂苷A3、白头翁皂苷B4、23．羟基白桦脂酸、刺人参皂苷S、白头翁皂苷B、白头翁皂苷C、筋骨草甾酮C和p．蜕皮甾酮。结论：从白头翁中分离鉴定了9个化合物，其中3个化合物为首次从该植物中发现，分别为刺人参皂苷S，筋骨草甾酮C和p．蜕皮甾酮。第二部分液质联用技术同时测定白头翁中9种化学成分及其质量表征目的：建立HPLC．MS法测定白头翁中白头

5、翁皂苷B4(1)，白头翁皂苷A3(2)，23．羟基白桦脂酸(3)，刺人参苷S(4)，白头翁皂苷C(5)，白头翁皂苷B(6)，齐墩果酸(7)，p．蜕皮甾酮(8)和筋骨草甾酮C(9)含量的方法。方法：采用SapphireC18柱(250mm×4．6mm，5rtm)；流动相：A(甲醇含O．1％甲酸)-B(0．1％甲酸水溶液)，梯度洗脱程序为0-6min(75％．95％A)，6．14min(95％A)，随后回到最初75％A并持续到21min；流速为O．8mL·min"‘。采用电喷雾离子源进行正离子和负离子模式检测，多反应监测模式(MRM)用于定量测定。正离子

6、监测模式下源喷射电压设置为5500V；负离子监测模式下源喷射电压设置为．4500V；离子源温度为650℃。雾化气(Gasl)：40psi，加热气(Gas2)：50psi，接口持续加热，帘气25psi，全程氮气通入状态。扫描方式采用多重反应监测(MRM)；碰撞气(CAD，N2)压力为medium；Q1和Q3分辨率均为UNIT。结果：峰面积与浓度呈良好的线性关系(r2>0．9948)；日内和日间精密度分别小于2．78％和2．68％，并应用于20批次不同来源白头翁药材的含量测定。结论：本研究中建立的分析方法灵敏度高、专属性好，可为白头翁药材质量控制提供一个

7、强有力的工具。有助于规范白头翁药材的质量，并能够在一定程度上指导中医临床用药的合理性。第三部分液质联用技术定性鉴定白头翁中五环三萜皂苷类成分目的：对白头翁进行超声提取后即进行HPLC．MS分析，研究8个五环三萜皂苷类化合物的特征碎片离子，推测其电喷雾质谱裂解规律，再将此规律应用于白头翁中未知羽扇豆烷型和齐墩果烷型三萜皂苷类化合物的中文摘要结构推测，根据已知裂解规律尽可能多的推测出白头翁中五环三萜皂苷的化学结构。方法：采用了MRM。IDA．EPI和PREC．IDA．EPI两种模式分析未知五环三萜皂苷类化合物。取白头翁药材粉末(40目)5g，加70％甲醇

8、25mL，称重，冰浴超声提取lh，称重，用70％1甲醇补足减失的重量，0．45larn微孔滤膜滤过，滤液减压