番茄花叶病毒外壳蛋白与烟草铁氧还蛋白ⅰ及ip-l蛋白的互作分析

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1、西南大学硕士学位论文番茄花叶病毒外壳蛋白与烟草铁氧还蛋白Ⅰ及IP--L蛋白的互作分析姓名：武改霞申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：孙现超201206摘要番茄花叶病毒外壳蛋白与烟草铁氧还蛋白I及IP．L蛋白的互作分析研究生：武改霞指导教师：孙现超副教授番茄花叶病毒(7a朋口fD胍渊fcvfr淞，TcIMⅣ)是烟草花叶病毒属(乃施胍伽f例，)的成员之一，基因组为单链正义RNA，大小约为6．4kb，编码了3个非结构蛋白和17．6kDa的外壳蛋白(coatproteiIl，CP)。通过汁液机械摩擦传播及种子带毒传播，番茄是其主要的寄主，对番茄的品质和产量造成了严重的影响。国内外研究

2、者对TOMV生物学和分子生物学特性方面做了大量的研究，为防治该病毒积累了丰富的资料。但该病毒与寄主相互作用的机制尚不完全清楚。铁氧还蛋白I(矗：n℃dox访I，FdI)和m．L是前期工作在烟草体内发现的可以与TOMVCP在体外互作的蛋白，为了进一步了解ToMv与寄主的互作机制，本文对TOMvCP与烟草FdI及P-L的互作进行了初步分析。本实验室的前期工作已经发现ToMvCP与铁氧还蛋白I(删oxiIlI，FdI)可以相互作用。为了进一步确定TOMVCP与FdI互作的最小结合域．本文在前期的基础上，利用酵母双杂交技术研究了TOMvCP与FdI的互作区域。首先。根据预测的Fdl结构域，对

3、烟草FdI进行分段缺失，分别为Fd△N47、Fd△N7l和Fd△N112。并构建至酵母表达载体pGADT7，用酵母双杂交方法分析pGBl∞CP与缺失片段的互作情况。结果表明，Fd△N47、Fd△N71和Fd△Nll2均能与pGBKT7CP互作，其中，Fd△Nl】2和pGBKT7CP的互作程度较弱。同时。将实验室保存的重组质粒pGBKT7CP△N31、pGBKT7CP△N54、pGBKT7CP△N106分别与pGADT7．FdI全长进行双杂交，结果显示3个缺失片段均可与FdI互作。综合以上结果暂确定TOMVCP与FdI的最小结合域分别为TOMVCPC端含有a螺旋区的54个氨基酸及FdI

4、C端32个氨基酸。为了确定FdI与ToMVCP的互作是否特异，本文将实验室保存的烟草花叶病毒(死坛ccDm∞口缸们，．凇．TMV)、黄瓜花叶病毒(Ckc“m6∥脓碱啦w，．埘，CMⅥ、马铃薯X病毒(尸ID幻幻w，．淞XPVX)、烟草脆裂病毒(乃6口ccD，口舭vf，懈，TRV)的CP。分别与FdI进行酵母双杂交分析，结果表明，TMVCP、CⅢCP、PvXCP、TRVCP均能与FdI互作，说明FdI与TOMVCP的互作是非特异的。为了进一步确定ToMvCP与烟草FdI和m．L在烟草体内的互作情况，本文构建植物表两南大学硕十毕业论文达载体pSPYCE一35S-Fd、psPYNE·35S．

5、CP和pSPYCE一35S-工P-L，利川双分子荧光互补技术分析了其互作情况。结果表明，ToMVCP与烟草FdI和口-L在烟草叶片活细胞内互作。为了检测病毒侵染寄主后，寄主蛋白在植物体内的表达情况，本文构建了P．L基因的原核表达载体pEGx．口．L，并导入大肠杆菌BL2l中。在37℃培养、1．0眦no儿口1’G诱导条件下表达出融合蛋白GST．口．L，SDS-PAGE电泳检测分析表明成功表达出分子质量约为44．6kDa的目的融合蛋白GST-IP．L。以表达的融合蛋白为抗原，免疫家兔，制备的抗血清的效价为们600。用获得抗体进行west锄b10t分析表明该血清具有良好的特异性，可用于检测

6、病毒侵染寄主后寄主蛋白在植物体内的表达情况。关键词：番茄花叶病毒：外壳蛋白；酵母双杂交；双分子荧光互补；W醅t伽blotnABSTRACTAnalyzingtheInteractionbe佃eenTomat0MosaicViruSCoatProteinandTobacc0FerredoxinIorIP．LancIl0DaCC0■errecl0Xlnl0rlr—LCandidate：GaixiaⅥhSupervisor：XianchaoSunCollegeofPlantProtection，SouthwestUniVersityABSTRACT乃MfD舢衄缸V批(删)，a胀m1)cro

7、f吐圮7b6口肌D协懈g蹦嘴，h雒apositive-se璐esillgIe—strandcdIⅢAgcIloIneofabout6400锄c100tid髂in1eIlg吐1’which饥cod嚣111I优non—s仃uctIl】ralproteills觚dal7．6．1(DacoatprotIein(CP)．TOMVcaIlifl

8、饶ttomatoviajuice锄dsecddiss即millation，∞llsillg∞Ve陀iIl-fluence0n