蛋白-核酸互作研究方法

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1、蛋白-核酸互作研究方法蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。蛋白-核酸互作是机制研究的重要组成部分，是表现、功能等研究的进一步深化。今天小编以一篇经典文献带你了解蛋白-核酸互作研究方法经典文献解读：MYC调控的长链非编码RNA（lncRNAs）在细胞周期调控和肿瘤发生中的作用基本信息题目：RoleofMYC-RegulatedLongNoncodingRNAsinCellCycleRegulationandTumorigenesis期刊：JournaloftheNationalCancerInstitute(

2、JNCI)影响因子：12.589主要技术：RNApull-down,LC-MS/MS,ChIP,RIP研究背景哺乳动物基因组编码大量的非编码RNA，如microRNAs、piRNAs和lncRNAs。迄今为止，已经注释或鉴定了3万多个lncRNAs。目前已经在几种癌症中鉴定到lncRNAs，在结直肠癌（CRC）中也有一些报道，如CCAT1和CCAT2，但大部分lncRNAs在CRC中的作用仍然鲜为人知，有待阐明。已知转录因子MYC调节lncRNAs并且与癌细胞增殖和肿瘤发生相关。本文作者利用荧光素酶启动子测定，ChIP，RNApull-down，缺失图谱测定，LC-MS

3、/MS和RIP等方法手段来探索MYC调控lncRNAs的相关机制。研究内容及结果1.鉴定结直肠癌（CRC）中特异表达的lncRNAs作者利用lncRNAs基因芯片来分析正常结肠来源和CRC来源的细胞和组织中的lncRNAs。结果获得30215个蛋白质编码转录本和33045个有注释或已知的lncRNAs。其中在CRC中具有表达差异的蛋白质编码转录本（2212/30215）和lncRNAs(2325/33045)具有相似的比例，均为7%（图1，A和B）。在2325个差异表达的lncRNAs中，有1265个上调和1060下调（图1C）。作者选取差异倍数大于15倍，P<0.01

4、的差异表达的lncRNAs进行RACE快速扩增,然后利用qRT-PCR进行验证。结果有4个lncRNAs（CCAT3、CCAT4、CCAT5和CCAT6）在CRC细胞系中上调表达（图1,D-G），CCAT7和CCAT8在CRC细胞系中下调表达（图1，H-I）。利用52个CRC组织和它们临近的正常组织（NATs）进行验证也证实了上述结果（图J-O）。图1鉴定结肠直肠癌（CRC）中差异表达的lncRNAs2.进一步鉴定原癌基因MYC调控的CRC相关lncRNAs为进一步鉴定由MYC调控的CRC相关lncRNAs的差异表达，作者利用lncRNAs微阵列筛选siMYC处理的CR

5、C派生细胞系中的lncRNAs。结果，在HCT116细胞系和RKO细胞系中分别鉴定到324、863个由MYC调节的lncRNAs（图2B,C）。通过进一步筛选获得MYC上调的三种lncRNAs（AK021907，AC074389.9和KTN1-AS1）（图2D）。这些由MYC调控的lncRNAs被命名为MYCLos（MYCLos-1，MYCLos-2，MYCLos-3）。接下来作者研究了由MYC介导调控的MYCLos在各种癌细胞中是否常见。结果表明，在各种癌症类型的细胞中都能观察到MYC介导调控MYCLos，表明MYC介导调控MYCLos在多种类型的癌症中是保守的（图2

6、E-G）。为了进一步验证MYC与MYCLos之间的关系，作者还研究了50个人类原发性结直肠癌组织样本(25个正常结肠和25个CRC组织样本)的表达水平，根据MYC表达水平分为4个组(图2H)。通过比较四组中MYCLo-1，-2和-3的表达水平，发现MYCLo-1，-2和-3的表达水平与MYC的表达水平在统计学上显著相关（图2，I-K）。此外，MYCLos在含有MYC过表达的CRC细胞系（图1G）中高度表达（图2A）。为测试MYC是否在转录水平调节MYCLo-1，-2和-3，作者利用荧光素酶报道分子对其进行了测定。结果表明，MYC基因抑制后，MYCLos启动子的活性降低，

7、表明MYC在转录水平上诱导MYCLos表达（图2，L-N）。这些结果表明MYC诱导的MYCLos在转录水平上由转录增强子MYC直接调节。图2鉴定由MYC直接调控的CRC相关的lncRNAs3.MYC诱导的MYCLos对CDKN1A、CDKN2B等MYC靶基因细胞增殖和表达的影响原癌基因MYC通过调节许多细胞周期调节基因来促进细胞的增殖。作者将MYCLo-1，-2或-3以及MYC进行敲除，结果细胞增殖减少（图3A，3B）。敲除MYCLo-1或-2导致细胞在G1期积累，表明MYCLo-1和-2参与G1/S转换（图3D）。敲除MYCLo-3导致