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1、核酸－蛋白质互作的生物化学研究方法张金璧,潘增祥,林飞,马雪山,刘红林南京农业大学动物科技学院,南京210095摘要:研究核酸－蛋白质的互作是揭示生命活动机理的基础,文章简要综述了用于研究核酸－蛋白质互作的各种生物化学方法。从体内、体外两个研究角度,针对核酸、蛋白以及复合物3个研究水平,概述了硝化纤维膜过滤实验、足迹法、EMSA、Southwestern杂交等经典分析方法的原理、发展和运用。还着重介绍了最近在表观遗传学领域中广泛运用的nChIP、xChIP等基本染色质免疫沉淀(ChIP)技术及其衍生出的ChIP-on-chip等方法。
2、关键词:核酸;蛋白质;互作;足迹;染色质免疫沉淀BiochemicalmethodsfortheanalysisofDNA-proteininteractionsZHANGJin-Bi,PANZeng-Xiang,LINFei,MAXue-Shan,LIUHong-LinCollegeofanimalscienceandtechnology,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,ChinaAbstract:InvestigationofDNA-proteininteractionsis
3、fundamentaltounderstandthemechanismunderlyingavarietyoflifeprocesses.Inthisarticle,varioustypesofbiochemicalmethodsinDNA-proteininteractionstudyinvivoandinvitroatthelevelofDNA,protein,andthecomplex,respectivelywerebrieflyreviewed.TraditionalassaysincludingNitrocellulose
4、filter-bindingassay,Footprinting,EMSA,andSouthwesternblottingweresummarized.Inaddition,chromatinimmunoprecipitationtechniquesincludingnChIP,xChIP,andChIP-on-chip,whichwerewidelyusedinepigenetics,wereparticularlyintroduced.Keywords:nucleicacid;protein;interaction;footpri
5、nting;chromatinimmunoprecipitation(ChIP)核酸－蛋白的互作在生命活动中发挥着广泛而重要的作用,二者的协作是各种生命现象的基础。将细胞或细胞器中的蛋白质、核酸等生物大分子的相互作用联系起来,是综合研究一个完整的生物学途径的核心内容[1]。近半个世纪以来,研究者们在核酸－蛋白质复合物的构成和分解过程中进行了大量探索,发展了一系列研究其互作关系的方法技术,其中,生物化学相关方法一直是重点与主流。生物化学法主要利用酶或其他化学制剂,通过切割、修饰等作用来分析或分辨存在相互作用的核酸和蛋白复合物,研究其间潜
6、在或实际的结合能力和结合方式。其中DNaseⅠ、ExoⅢ足迹法以及更加精练的足迹技术,如羟基自由基足迹分析、保护/干扰实验等,在鉴别潜在的DNA靶点的基础上可进一步用于研究DNA-蛋白复合物中的DNA构成;消化纤维膜过滤法、凝胶阻滞分析以及Southwestern印迹等能用作结合位点确定后相关蛋白的分离分析;随着表观遗传学的兴起,建立在DNA-蛋白交联基础上的染色质免疫沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)技术迅速发展起来,成为探索复杂的DNA-蛋白复合物结合情况的重要手段,被广泛运用于转录复合体和
7、组蛋白修饰的研究。本文就相关方法的原理、应用及发展情况,从体内、体外两个方面进行综述。1体外的生化研究方法在对于蛋白质－核酸互作的多数研究,尤其是早期研究中,目的蛋白和目的核酸被分别提取出来,在人工条件下进行孵育结合,进行相关研究。虽然实际上在生物体中,二者有可能因为空间、电荷等各种关系无法接近而产生作用,但体外方法有效地体现了核酸和蛋白质能够发生互作的潜力,为核酸－蛋白质研究所广泛运用。1.1硝化纤维膜过滤实验膜过滤方法在核酸－蛋白质复合物研究中渊源已久,最初用于RNA－蛋白质的互作研究[2],后由Jones和Berg[3]于196
8、6年首次将其用于DNA－蛋白质的研究中。其原理是蛋白与硝化纤维膜(Nitrocellulosefilter,NCF)结合,但DNA不与其结合。将标记过的DNA与蛋白质共同孵育,用NCF过滤混合物,则DNA能够通过NCF,
