我国苹果主要病毒的检测及苹果褪绿叶斑病毒分子变异的研究

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1、河北农业大学硕士学位论文我国苹果主要病毒的检测及苹果褪绿叶斑病毒分子变异的研究姓名：冀志蕊申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：王亚南；曹克强20120530摘要

2、I

3、

4、IInIⅢM

5、HY2143724苹果病毒病在世界各地广泛分布，影响严重，具有危害性强、传播扩散快和难以治愈的特点。苹果病毒破坏和干扰果树正常生理功能，导致树势减弱，产量降低，果实品质下降，造成严重的经济损失。本论文针对我国四种主要苹果病毒苹果花叶病毒(么印彪mosaicvirus，ApMV)、苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspo

6、tvirus，ACLSV)、苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus，ASPV)和苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus，ASGV)进行研究。主要取得了以下研究结果：1．建立了能够稳定应用于田间四种苹果主要病毒检测的RT-PCR体系：确定了适合苹果总RNA提取的最佳提取方法一RNA改良提取法；对用于四种病毒RT-PCR检测己发表引物和自行设计引物进行筛选；确定了最佳引物，并对各病毒RT-PCR检测体系和程序进行优化。优化的RT-PCR检测体系能够对四种苹果病毒进行周年检测，ASPV、ASG

7、V、ACLSV和ApMV检测灵敏度分别为总RNA模板的2,000x稀释液、5,000×稀释液、10，000x稀释液、200x稀释液。2．通过对我国13个省(市／区)327份材料进行检测，明确了我国苹果产区四种病毒的发生及分布：四种苹果病毒病在我国苹果产区普遍发生，ApMV、ASPV、ASGV和ACLSV的平均侵染率分别为80．1％、65．1％、73．7％和69．7％。病毒混合侵染现象普遍，两种病毒混合侵染率为16．5％，三种病毒混合侵染率为51．1％，四种病毒混合侵染率为26．9％。其中ApMV+ASGV+ACLSV+ASP

8、V复合侵染率最高，为26．9％，其次为ApMV+ASGV+ACLSV，侵染率为16．8％；ACLSV+ASPV混合侵染率最低，为0．3％。3．建立了能够同时检测四种苹果病毒的多重RT-PCR检测体系：利用携带ASPV、ASGV和ACLSV的组培苗及田间ApMV染病组织为材料，对四种病毒的RT-PCR检测引物组合进行筛选，在此基础上加入苹果内源基因引物，并对检测体系和程序进行优化。结果表明：引物ASGVs．5’／ASGVs-．3’、2002ASPV-5’／2002ASPV-3’、ACLSV4．5’／ACLSV4．3’及EF-l

9、a一5’／EF-la一3’组合能够同时特异性检测四种苹果病毒和苹果内源基因。ASPV、ASGV、ACLSV和ApMV检测灵敏度分别达到2,000×、1，000x、1,000xffH100x总RNA模板稀释液。最后通过检测田间样本明确了所建立的多重RT-PCR检测体系在田问应用的可能性。4．初步明确了我国苹果上ACLSV的分子变异情况：对来源于我国不同地域、不同品种的54个ACLSV分离物的部分CP序列进行了测定，与已报道的66个ACLSV分离物进行序列同源性比较和系统进化树分析。发现我国苹果上ACLSV分离物处于2个不同组群

10、，组群I包含了与已报道的“B6型"分离物亲缘关系较近的38个分离物，其中20个分离物CP氨基酸变异位点较为特殊，在系统进化树中与已报道的“B6型"分离物处于组群I的不同亚组中。组群II包含与已报道“P一205型”分离物亲缘关系较近的16个分离物。经过对来源于不同寄主、不同种植地域、不同苹果品种的ACLSV分离物进行分析，发现ACLSV的变异与寄主种类有一定的相关性，与种植地域无明显相关性，与苹果品种可能有相关性。关键词：苹果病毒；RT-PCR；多重RT-PCR；分布；分子变异Thedetectionofmainapplevi

11、rusesandthemolecularvariabilityanalysisofApplechloroticleafspotvirusinChinaAuthor：JiZhi—ruiAdviser：WangYa—nanCaoKe—qiangSpecialty：PlantPathologyAbstractApplevirusdiseasesarewidelydistributedthroughouttheworld，spreadingfastanddifficulttocure．Virusinterferethenormalp

12、hysiologicalfunctionoftheappletree，affectthefruitqualityandcausegreateconomiclose．RT-PCRtechniquewasusedtodetectfourappleviruses，includingApplech