微损伤环境下干细胞移植治疗骨不连的动物试验研究

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1、河北医科大学硕士学位论文微损伤环境下干细胞移植治疗骨不连的动物试验研究姓名：张虎申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：张卫平201203中文摘要微损伤环境下干细胞移植治疗骨不连的动物试验研究摘要骨不连是目前骨科临床面临的重要难题之一，其治疗方案较多，但效果不一，干细胞治疗的兴起为骨不连的治疗从根本上提供了一种潜在的良好治疗方案，有着良好的应用前景。骨修复过程中，需要骨折部聚集数量足够的骨髓间充质干细胞(Bonem趾-rowmesenchymalstemcells，BMSCs)。所以，向骨折骨不连部位引入足够的MSCs是促进骨修复

2、的前提条件及重要的细胞学基础。由此干细胞就成为治疗骨不连的理想的种子细胞。干细胞移植治疗骨不连有着良好的临床应用前景，同时微损伤环境为干细胞提供龛环境，既结合了干细胞的修复功能的特性，又引入了局部微损伤的支持培养诱导分化环境。目的：本试验以兔桡骨骨缺损骨不连模型行微损伤环境下干细胞治疗，从示踪、病理、影像、统计等多个方面全面反应微损伤环境下干细胞移植治疗骨不连的疗效。方法：动物体内对照试验。选取20只新西兰大白兔，随机分为两组：试验组(干细胞组)和对照组(单植骨组)。抽吸兔的胫骨骨髓血，采用全骨髓贴壁培养筛选法分离培养兔BMSCs

3、。培养达至tJ107数量级后以超顺磁氧化铁纳米粒子(superparamagneticironoxide，SPIO)培养标记BMSCs备用。应用形成骨缺损法制作骨不连模型。选择兔前肢桡骨中段，截骨长度为15ram，观察时间为6周。造模成功后，试验组在局部微损伤环境下行取自体髂骨碎骨粒植骨，同时行同种异体干细胞移植术。单植骨组只行自体髂骨碎骨粒植骨。术后第1．12周分别进行相关检查对比观察，包括：1．大体形态学观察；2．病理学观察：HE染色和普鲁士蓝染色，反应成骨及细胞演化情况；3．MRI动态活体体内干细胞跟踪，扫描序列为：3Dfs

4、SPGRE、1’2·GRE、T1FSE。4．X线影像学的观察：术后对试验兔行X线检查，观察桡骨骨不连的骨质愈合及骨痂变化情况。5．利用实达PACS影像诊断工作站系统测量x线片各骨痂形成面积，所得2组骨痂面积对比，应用统计学SPSS软件分析两组数据，P<0．os月lU认为有统计学意义。中文摘要结果：20只新西兰大白兔全部存活，进入结果分析。1．干细胞分离培养扩增MSCs的形态学观察：分离后梭形细胞和多角形细胞显著增多，集落方式生长，数量逐渐增多，呈现长梭形、纺锤形，消化传代扩增纯化至第3代备用，干细胞数达到107数量级。干细胞呈纺锤

5、形和长梭形，且具有干细胞物理性贴壁粘附及集落生长的特性鉴定为兔BMSCso2．造模6周后，观察试验兔全部成活良好。患肢切口愈合良好，活动良好，触摸可及桡骨段缺损凹陷。X片示：桡骨中段骨质缺损无骨性连接，断端硬化，骨髓腔封闭。3．在骨不连植骨术后第1．12周分别进行干细胞组与单纯植骨组相关对比观察。3．1大体形态学观察：术后3周标本观察两组外形差异不大。术后6周观察干细胞组骨痂较大；单纯植骨组对照侧可见骨痂明显减少，植骨碎骨粒吸收。术后8周干细胞组见骨痂明显增大，植入碎骨粒融合，骨不连缺损愈合良好；植骨组可见骨髓腔大部封闭，肉芽组织

6、增生。术后12周观察干细胞组完全修复，单植骨组植骨吸收，髓腔闭塞，肉芽组织填充。3．2SPIO标记的干细胞，标记后的BMSCs在T2WI、尤其GRE(T2*WI)序列信号明显降低，在T1FSE序列中片状植骨区内可以分辨出中等点状圆形信号，提示为标记的BMSCs的典型表现，能够较好的分辨干细胞。随着时间的推移干细胞增殖代谢致使干细胞核磁显影逐渐降低，大约观察时间在8周左右，表明8周内标记的干细胞具有活力。单植骨单植骨组无相关改变。3．3各组治疗术后骨缺损不连X片成像结果：术后2周干细胞组与单植骨组桡骨X线检查无明显差异。自第3周可以

7、明显看出单植骨组较干细胞组骨粒密度及面积明显降低减少。4周后可见单植骨组骨颗粒明显减少吸收；干细胞组在骨缺损区可见云雾状新骨生长的改变。6周单植骨组可见骨颗粒大部分吸收，骨髓腔部分闭塞；干细胞组缺损区呈云雾状影，骨痂丰富，骨髓腔部分再通。术后8周单植骨组缺损区无骨性连接，植骨吸收；干细胞侧呈大骨痂，缺损区呈骨性连接，骨髓腔再通。术后12周单植骨组缺损区无骨性连接，断端硬化，骨髓腔封闭；干细胞组缺损区呈骨性连接，骨髓腔再通，塑性良好。2中文摘要3．4病理组织学：2周时两组组织病理形态对比差异不大。可见纤维结缔组织、大量炎性细胞聚集，

8、可见大量死骨碎片。3周干细胞组病理切片可见大面积软骨细胞增生活跃。单植骨组死骨数量较多，软骨增生较差。6周时干细胞组骨粒植骨融合，可见新生类骨质，成骨细胞增多，普鲁士-蓝染色可见局部细胞胞内蓝染颗粒阳性的干细胞，干细胞已经部分分化为成骨细胞；单植骨