广西猪jev fc792分离株全基因序列的测定与分析及rt-lamp的建立与e基因抗原域的原核表达

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广西大学硕士学位论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT--LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达姓名：卢冰霞申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：黄伟坚20120628 广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达摘要流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis，JE)是由乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)引起的一种十分重要的人畜共患的急性传染病，其主要流行于亚洲的东部和东南部以及澳大利亚等地区，其引起的死亡率可达20％以上。根据世界卫生组织的统计，乙脑年发病人数已达35000例，其中中国的发病人数占到了80％。JEV可感染猪，引起妊娠母猪流产、公猪睾丸肿大和仔猪神经系统疾病，给养猪业造成了巨大的损失。猪是JEV主要的储存和扩散宿主，因此对猪感染乙脑的诊断与防制具有重要的公共卫生学意义。首先，本研究以JEVSA14为模板设计JEV特异性引物，分7段扩增JEV广西分离株FC792全基因，经序列测定与拼接后得到FC792分离株全基因组序列。FC792株全长10977个核苷酸，其中5’非编码区有95个核苷酸，3’非编码区有586个核苷酸，开放阅读框含10296个核苷酸，共编码3432个氨基酸。核苷酸与氨基酸同源性分析发现FC792株与国内外JEV代表毒株的核苷酸同源性为84．6％．99．7％，氨基酸同I 源性为96．2％．99．4％。其中与SAl4．14．2和YUNNAN0901株核苷酸同源性分别为99．7％和99．6％，氨基酸同源性分别为99．4％和99．2％。遗传进化分析表明FC792株属于基因ⅡI型，且与YUNNAN0901和SAl4．14．2株的遗传进化关系最为接近。FC792株与YUNNAN0901株核苷酸的差异率仅为o．45％，氨基酸差异率为O．76％，结构蛋白含有5个氨基酸的差异。其次，本研究建立了JEVRT-LAMP检测方法，并进行了反应体系和反应条件的优化，灵敏度实验表明本研究建立的JEVRT-LAMP检测方法的检测极限为O．5pg，特异性实验证明其具有较高的特异性。与RT-Nested．PCR比较，两种方法检出率的符合率为90．9％。而且反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察，大大缩短了检测时间。第三，克隆出JEVFC792株包含E基因抗原域I和抗原域II的基因片段Ea，成功构建出原核表达质粒pET．32a．Ea。用JEV阳性猪血清作为一抗进行Western．blot分析，初步表明重组蛋白Ea具有抗原性，纯化复性重组蛋白Ea，免疫小鼠2次，间隔1周，二免一周后眼球采血、分离血清，经包被JEV全病毒的ELISA试剂盒检测为阳性，说明Ea具有抗原性；ELSIA检测为阳性的小鼠血清进行病毒的中和试验，结果表明免疫组小鼠血清具有中和JEV的能力，中和抗体效价为1：70，说明Ea具有较好的免疫原性。II 关键词：乙型脑炎RT-LAMP全基因组序列测定与分析E基因免疫原性III GENOMESEQUENCINGANDANALYSISOFPIG旭VGUANGXIISOLATESTRAINFC792，ESTABLISHINGTHEMETHODOFTHERT-LAMP,ANDPROKARYOTICEⅫRESSIONT髓EGENEOFFC792STRAINABSTRACTJapaneseencephalitis(厄)isacuteinfectionsdisease，whichcausedbyJEV，andit’Soneofmostimportantdeseaseforbothhumanandlivestock．MainlyOccursintheEasternandsouthEasternofAsia，Australiaandotherregionsandcountries，itsmortalityratedupto20％．AccordingtotheWorldHealthOrganization，thenumberofJEincidencehadreachedto35000eachyear，amongthemChinaaccountedfor80％．JEVcaninfectpigs，causingtheabortionofpregnantSOWS，boarstesticularswellingandpigletsnervoussystemdisease，SOascausedhugelossestothepigindustry．PigsarethemainstorageandproliferationhostforJEV，SOtherehasimportantpublichealthsignificancetodiagnosisandcontrolofpigsinfectedwith厄V．V Thisstudy，usedtheJEVSA14strain’SgenomesequenceastemplatedesignJEVspecificityprimers，dividedseven—segmentamplificationofJEVgenomesequenceofFC792isolatestrain，aftersequencingandsplicing，gotthefullgenomesequenceofFC792．Thefull-lengthofFC792has10977nucleotides，5'noncodingregioninclude95nucleotides，3’noncodingregionhas586nucleotides，anopenreadingframecontaining10，296nucleotides，whichencodes3432aminoacids．ThenucleotidesandaminosequenceanalysisrevealedthatFC792comparewiththebroadanddomesticJEVrepresentativesstains，it’Snucleotideshomologyshared84．6％to99．7％，aminoacidhomologywere96．2％to99．4％．Therewerea99．7％and99．6％homologyofthenucleotide，99．4％and99．2％homologyoftheaminoacidbetweenSA14·-14--2andYUNNAN0901strains，respectively．PhylogeneticanalysisshowedthattheFC792strainbelongedtogenotypeIIItype，andthephylogeneticrelationswasthemostclosesttotheSAl4．14．2andⅥ删AN0901strains．Thenucleotideswasonly0．45％，aminoacidwas0．76％，thestructuralproteincontainingfiveaminoaciddifferencesbetweentheFC792andⅥ小烈AN0901strains．EstablishedthedetectionmethodofJEVRT-LAMP，andoptimizedthesystemandtheconditionsofreaction，thesensitivityexperimentsshowedthatthedetectionlimitoftheJEVRT-LAMPVI methodwhichestablishedinthisstudywas0．5pg，thespecificexperimentsprovedithadhighspecificity．AftertheendoftheRT-LAMPreaction，byaddingSYBRGreenItovisualizeobservation，greatlyreducingthedetectiontime．ClonedtheJEVFC792strain’SEgenefragmentsEa，whichcontainingtheantigenicdomainIandII；wassuccessfullyconstructedtheprokaryoticexpressionplasmidofpET-32a—Ea．TheWestern—blotanalysiswasusedtheJEVpositiveserumofswineastheprimaryantibody，initiallyshowedthattherecombinantproteinEahadantigenicity；purificationrefoldingofrecombinantproteinEa，immunizedthemousetwiceintervaloneweek，eyesbloodtoseparateserumaweekafterthesecondimmunization．WaspositivethattestedbytheELISAkitwhichpacketedwith厄V，indicatingthatEahasantigenicity；usedthepositivemouse’SserumwhichdetectedbyELISAtodothevirusneutralizationtest，andtheresultsshowedthattheserun'lofmiceimmunizationwiththeabilityofneutralizingJEV，andtheneutralizingantibodytiterwas1：70，demonstratethattherecombinantproteinEahasgoodimmunogenicity．KEYWORDS：Japaneseencephalitis；RT-LAMP；whole—genome；sequencingandanalysis；Egene；immunogenicityVII 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析反RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原梭表达1。1日本乙型脑炎简介第一章综述黄病毒家族的病毒病原体分为3个属，其中包括黄病毒属，肝炎病毒属和瘟病毒属。黄病毒是已知的导致人类的许多疾病。日本脑炎病毒(JEV)，西尼罗河病毒(WNV)，登革热病毒(DENV)，黄热病病毒(YFV)和蜱传脑炎病毒(TBEV)是最常见的感染性黄病毒。大多数黄病毒是通过虱子和蚊子等媒介传染给人类，因此，这些感染也被称为节肢动物传播的病毒感染或虫媒病毒感染。根据传播媒介的不同，黄病毒可分为3个亚群。(如图1)墨iP——～⋯⋯⋯⋯——点⋯⋯————⋯——————、l，⋯～●⋯⋯～⋯⋯⋯⋯————⋯⋯⋯、豳圈工⋯，．．』j．．．．．：～。圈一幽圈圈墨雹L圈L函￡面F函L面L一图1黄病毒的分类Fig1ClassificationofFlavivirus．日本脑炎(乙脑)是由乙脑病毒引起的一种病毒性疾病。全球每年大约有45000人发病，10000人发病死亡【11。约有25％的脑炎患者死亡，而约有50％的P恒埋 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与g基因抗原域的原核表达幸存者存在永久性的神经或精神后遗症，包括记忆力减退，认知能力受损，行为障碍，抽搐，运动无力或瘫痪。乙脑是一种虫媒病毒，维持在人畜循环，可以是地方性和流行性。这个循环包括猪，主要的贮存、增殖宿主，水鸟作为携带者，蚊子作为媒介【1】。由于低水平的病毒血症，人类被认为是终末宿主(图2)。三带喙库蚊属于杂鳞库蚊群的蚊子是乙脑的主要传播媒介网，、白雪库蚊、白头库蚊被认为是次要的传播媒介【11。蚊子属于疟蚊种，例如，印度有报道称带足疟蚊隐藏乙脑病毒【3】。图2乙脑病霉的生物循环Fig2LifecycleofJEV1871年日本首次报道了感染乙脑病毒的临床病例的报道，随后在亚洲的东南部的温带和热带地区和澳大利亚相继报道【11。1935年从致命病例的脑中首次分离出乙脑病毒．中山株。一般情况下，两种流行病学的乙脑均有报道。在北亚地区，乙脑病毒常发生在夏季，而在南亚地区，乙脑的高发期发生在雨季【41。病毒基因型的改变和气温差异已被认为是影响乙脑流行的重要因素【41。 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的演4定与分析及RT—L蛳P的建立与E基因抗原域的原棱摹越1．2起源和传播1935年日本首次分离到JEV，但是早在1870年被报道岭J。JEV起始于印尼．马来西亚地区，由原始的黄病毒进化而来。从那里开始，它已经蔓延到亚洲的北部和西部，最近在澳大利亚也分离到了【5-1I。目前，通常用prM和E蛋白编码基因来分析乙脑的进化r71。目前己知的JEV有5个基因型。特定的气候条件有不同的基因型，基因Ⅳ型(最老的)和V型是印尼．马来西亚热带地区特有的，在流行地区发现基因III型和I型【&91。1995年在托雷斯海峡爆发了乙脑，当时人们认为，JEV是通过鸟类的迁徙在岛与岛、印尼的东部到新几内亚岛和托雷斯海峡之间传播。随后，认为JEV是通过受感染的蚊子随飓风一起蔓延到澳洲大陆的北部‘10-11，121。对黄病毒如乙型脑炎病毒的传播似乎也与全球化迅猛发展，人I：I爆炸，由于工业化和毁林导致全球气候条件的改变有关【13J(图1)。据疾病预防和控制中心公布的报道【14J研究人员认为，黄病毒如西尼罗河病毒是通过受感染的旅客、无意进入的感染的鸟类、和或带有感染性病毒粒子的蚊子来进入西部的。因此，极有可能在这样一种情况下传播JEV[15J。1．3乙脑病毒基因组乙脑病毒是囊膜病毒，直径约为50nlil，单股正链RNA病毒，全长约为11kb。基因组由由形成的多个副本衣壳蛋白(C)的衣壳蛋白组成：覆盖了宿主的派生脂双分子层。该基因组有一个开放阅读框，编码单一的多聚蛋白，它分为三个结构蛋白：衣壳蛋白(C)，前体膜蛋白(prM)，囊膜蛋白(E)和7个非结构蛋白NSl，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5。在开放阅读框两端的5’和3’非编码区是病毒复制、转录和翻译的重要顺势作用元件(图3)。在基因组RNA的5’末端有I型帽子(m7GpppAmp)，3’端缺乏poly(A)尾巴。C、prM、E基因核酸序列和系统发育分析显示全世界有5个基因型的JEV，分别为基因型I，II，III，IVandV【16-181。血凝抑制(HI)和单克隆抗体、多克隆抗体的中和实验可以用来区分同一基因型的不同菌株【19，201。3 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的囊}丘与E基因抗原域的原核表达鬟C·capsld骧M-membr枞印M-pr靛懈∞¨睁椎蛳h蠢nt纛E-envelope|巧-n蛳structuralpro瞧|n臻sI舻嗣瓣e缫牲S弘錾牲S2S．,NS3serineprot确se图3乙脑病毒的基因组构成Fig3JEVGenomeOrganizationN51‘·NSlextensionproteinU豫·Un骗蚋叠a自一黜罐硼C蛋白约有120个氨基酸并且形成二聚体。它涉及病毒基因组的包装和核蛋白的形成【烈J。prM蛋白(约165个氨基酸)，E蛋白(约500个氨基酸)有两个螺旋跨膜糖蛋白。他们从初期的多聚蛋白中释放后，被信号肽酶共翻译后裂解而来。在不成熟的病毒颗粒中，prM蛋白可能作为E蛋白装配和折叠的伴侣。在黄病毒在高尔基复合体成熟的过程中，prM蛋白被细胞的成对碱性氨基酸酶裂解形成M蛋白(约75个氨基酸)和蛋白质多肽。存在于宿主衍生脂双分子层的90％的E蛋8-聚体是形成成熟病毒粒子的组要成分【211。E蛋白由E基因编码，约500个氨基酸。E蛋白在病毒侵入宿主细胞的过程中起着重要作用，并且其诱导宿主产生体液免疫反应。研究已证实，无论是自然感染还是实验感染，E蛋白均可以诱导机体产生中和抗体【22,23】。E蛋白具有6个诱导机体产生抗JEV免疫反应的重要表位，其中4个为的B细胞表位【24之7】和2个T细胞表位[28,29]。Kolaskar等【30】对E蛋白氨基酸分析，发现E蛋白具4 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析反RT—LAIlP的建立与E基因抗原域的原校表达有3个抗原域：抗原域I，即中心域，由氨基酸残基1．51、137．196和293．311位共计128个不连续的氨基酸残基组成，域I内具有生物活性及血清学的抗原表位，E蛋白唯一的一个糖基化位点也存在于抗原域I；抗原域II，即二聚体化功能域，它由52—136和197．292位共计171个氨基酸残基所组成，抗原域具II内具有血凝活性和中和活性的抗原表位；抗原域IⅡ，由310—411位的连续的100个氨基酸残基组成，研究发现其与受体结合有关。黄病毒E基因序列已被认为与病毒的毒力有关。E蛋白是决定病毒毒力表型的关键，单一的氨基酸替代就可能导致的毒力或者神经侵染性的消失【31，321。在一项研究中，JEV分离株RP9(强毒株)和RP2(减毒株)具有不同的表型表现，这种差异已被归因于和RP2E蛋白的138位氨基酸不同，RP9的为谷氨酸，而RP2的为赖氨酸。RP9和RP2的另外一个差异为，PrM蛋白的43位氨酸，RP9为络氨酸，而RP2为组氨酸。由于PrM蛋白N端92个氨基酸将被裂解，而不会存在于成熟的乙脑病毒粒子中，因此在E蛋白138位置的单一氨基酸的变化是引起毒力差异的原因【331。E蛋白是机体中和抗体产生的主要靶蛋白，包含一个细胞受体结合位点和融合肽‘341。NSl蛋白，分子量大小为48KDa，是一种分泌型糖蛋白。它可以引起在宿主的保护性抗体反应【351。NSl’也被认为是NSl的扩展蛋白(大小为53l①a)，己被报道在JEV的感染细胞中存在‘361。NS2A，是一个小的疏水性、膜相关蛋白，参与RNA的复制。它充当翻译后切割NSl-NS2A的结点的作用，同时也在病毒复制酶复合体、病毒的装配和分泌中起作用。它还通过抑制干扰素的信号通路来调节机体的抗病毒反应【371。NS2B仍然是一个延续到NS3的异质二聚体，并且有助于该异质二聚体锚定到内质网膜上。它作为NS2B-NS3丝氨酸蛋白酶的一个辅助因子，在裂开病毒多聚蛋白NS2A／NS2B，NS2B／NS3，NS3／NS4A，andNS4B／NS5的连接中起作用【38，39】ONS3借助与它的RAN解旋酶和核苷三磷酸酶的活性参与病毒的复制和病毒的装配【40，411。NS4A是低疏水性蛋白，是IFN拮抗剂H21。在JEV所有的蛋白中，NS5最 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的奠臼乞与E基因抗原域的原核摹；达大，在它N端有活化的甲基转移酶，在C端有活化的RNA依赖RNA聚合酶‘331。它通过阻断IFN介导的JAK．STAT信号通路(由防止TyK2络氨酸酶磷酸化和活化STAT串联)来作为IFN拮抗剂【431。1．4．病毒的复制JEV通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞【44，451。许多不同的分子学已报道，JEV与细胞表面有相互作用[461。据报道，通过牛乳铁蛋白阻断硫酸乙酰肝素，可以降低JEV在BHK-21细胞中的侵入性和感染性[461o已经被鉴定，大小为74KDa的热休克蛋白70(HSP70)，在C6／36蚊子细胞系中与JEVE蛋白有相互作用的关系【471。因此，已经被认为许多不同蛋白的复合体可能参与了绑定病毒吸附蛋白，而不是单一的受体。JEV在网格蛋白上覆盖着被膜小泡瞰】，核内体的酸性pHil起的E蛋白结构的改变，导致基因组释放到细胞质中(图4)。一个病毒复制复合体(RC)，是由NS蛋白(NS3和NS5)与宿主因素一起形成的【49】。紧随其后的是病毒基因组的环合作用，双螺旋的复制类型(dsI强)，使用病毒RNA形成病毒复制复合体。这涉及到由5’和3’非编码区的逆变互补介导的远程RNA相互作用。黄病毒基因组的环合作用确保所复制的病毒RNA分子是全长RNA[501。这个dsRF形成新的RNA链互补到父链叫(图4)。这种JEV复制的模式是不对称和半保留形成正链，10．100倍地对于负链的形成。细胞质是JEV复制复合体存在的组要场所。已经被报道，60％的聚合酶的活化与细胞质膜有关，20％与外核信封膜有关，剩下的20％与细胞核有关‘521。有报道称，复制复合体被膜环绕着，从广泛的蛋白酶处理中保护复制复合体【531。通过病毒复制复合体鉴定病毒RNA的．J顷势作用元件，发现病毒基因组的非编码区，需要病毒的成功复制【491。JEV3’非编码区有6个区域，从5’到3’依次为：v，x，I，II一1，II．2，和III。据报道，对于复制来说，域II．2和域III已经足够，但是其它区域也是必需的，以达到最大的复制效率【541。6 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析反RT—LAMP的月。屯与E基因抗原域的原核表达1．5．发病机制图4乙脑病毒的复制Fig．4．JEVreplication大量数据显示应经获得用于研究JEV感染的动物模型和体外研究。JEV由蚊子的叮咬开始传播。JEV可能有一个外围复制周期，体外研究表明，外周血单核细胞(PBMCs)包括单核细胞和巨噬细胞能被传染【55l。在这个点上有一种免疫反应，在大多数情况下清除感染，这可能解释了为什么在外周血中没有JEV。当感染发展到脑炎，病毒颗粒被认为是通过血液传播到次要位点，进一步复制有助于增强病毒血症。它形成一个快速的炎症反应，浸润着单核细胞和中性粒细胞。感染JEV后通过依赖和独立Myd88途径导致树突状细胞的功能性障碍【56】。脾脏树突状细胞数量也被发现改变了随后的JEV感染，优先损耗树突状细胞的CD8a+CDllc+【571。树突状细胞表达各种协同刺激信号和粘附分子，可以激活未致敏T细胞，其功能障碍和损耗可以扩大病毒的传播，通过下调T细胞反应的CD8+和CD4+【57】。JEV入侵中枢神经系统可以通过正相反运输病毒粒子或通过血管内皮 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-L／!l$tP的建立与E基因抗周醴哎的原核表达细胞。乙脑病毒在血管内皮细胞的复制仍是一个有争议的问题158,59]。然而，在JEV感染期间确实发生了血脑屏斟59|。在中枢神经系统中乙脑病毒主要感染神经元，导致神经元的损失【6⋯，通过内质网应激途径引起细胞凋亡【61】(图5)。JEV在体外的不适当复制发现活性氧(ROS)介导中枢神经细胞死亡【62J。这是非常特殊的神经细胞，并且证明了有一个为鉴定的受体介导死亡信号转导通路。早期的研究证明了JEV对神经元的特异性。结果表明，神经元的粗面内质网(I冱R)是JEV复制的唯一场所163J。仍未知道，是否只有感染的神经元死亡或乙脑病毒也可以引起邻近未受感染的细胞死亡。据报道，相对于非衍生的神经母细胞来说，JEV可以在人类的衍生的神经母细胞中有效的复制[64】。成熟的神经元与病毒的传染性密切相关。JEV的感染实验模型证明，病毒趋向于未成熟的神经元[65,66]。成熟的神经元变得更加抵抗乙脑病毒引起的细胞凋亡，这种抵抗力可能是由于神经元表达了凋亡的细胞抑制剂，女Hbcl．2和bcl．X[67,68】。然而，更多的病毒的神经毒力可能会通过抑制细胞凋亡的抑制剂，导致成熟的神经细胞死亡【69】。JEV同时也感染神经前体干细胞，导致脑室下区的损失和损害。感染JEV的神经前体干细胞，其增生性大大降低了，降低了修复和再生受损的神经元的能力，使乙脑幸存者存在神经系统后遗症【70】。OeCfOSlS图5乙脑病毒的神经致病机理Fig．5·陀VNeu翟p础oge懈1s· 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LA肿的建立与E基因抗原域的屎棱表达虽然先前有报道说，在中枢神经系统中只有神经元感染JEV，最近的研究表明，星形胶质细胞和小胶质细胞也可以高效感染JEVt711。星形胶质细胞是血脑屏障的一部分，在中枢神经系统中扮演多个角色。一般来说，它们通过以糖原的形式贮存能量和产生具有解毒活性的酶来维持中枢神经系统的内稳态。在神经元损害的领域，突出的星形胶质细胞活化已被专门报道【721。在中枢神经系统中，小胶质细胞是驻地巨噬细胞，可以高效地被乙脑病毒感染，并可能成为病毒水库[711oGhosal等人报道说，活化的小胶质细胞可能在产生炎性介质诱导神经细胞死亡中起重要作用‘731。在体外培养系统和老鼠的大脑模型中，没有观察到潜伏的JEV感染细胞。据报道，在被感染的人类外周血中分离到潜伏感染的单核细胞【741，已被报道，在JE的幸存者中，约有5％的人出现中枢系统持续感染的现象r75】，但是仍然需要进行进一步研究来证实这些发现。1．6临床表现及病理变化大多数的JEV感染为无症状，只有少于1％的感染者出现疾病症状。JEV感染主要出现在15岁以下的小孩，但也有报道有成人感染。日本乙型脑炎的潜伏期为5．15天176J。典型的发热性疾病乙脑的表现为突然发热、头痛、背痛、肌痛和肌肉疼痛，厌食，并会持续一个星期。紧随其后的是精神状态的改变、步态和其他运动功能失调。在儿童，最初的表现疾病可能包括胃肠道症状，如腹部疼痛和恶心。疾病的进展可以分为3个明显不同的阶段，即出现中枢神经系统疾病之前的前驱期、脑炎阶段和病人康复完全或神经元的持续损伤的后期阶段r7|71。组织病理学检查出现特有的微胶质增生，形成微神经胶质结节。有报道，通过免疫组织化学染色可以在死亡或者退化的神经细胞中发现病毒的抗‘77,78J。胶质问质小结主要分布在浅表和深层的灰质，包括脑干，丘脑，基底节、海马体和前角细胞的脊髓。有报告在灰质会出现破坏神经性的病变，形似囊肿。遗留神经功能障碍的患者的丘脑、黑质和海马体存在伤痕累累分枝状般横行的病灶【791。大脑检查发现大脑水肿，软脑膜充血【781。对病人进行核磁共振扫描发现在9 硕士论文广西猪JEVFC792分离糠全基因序列的测定与分析反RT—L,k～IP的建立与E基因抗原域的原核表达基底节、中脑和丘脑会出现特征性的混合强度或低密度的病变。虽然，病理异常发现本质上是在中枢神经系统，但也有报道会出现心肌和肺脏炎症，以及脾脏、肾脏和淋巴结网状内皮细胞的增生‘8们。1．6感染JEV后宿主免疫反应1．6．1体液免疫体液免疫在JEV感染中起到重要的作用。抗病毒的抗体已被报道作为应对虫媒病毒引起的脑炎一项重要的兵工厂。细胞外病毒通常通过抗体中和病毒的传染性以及吞噬清除病毒粒子而被清除。在神经感染的情况下，抗体会采取行动，出现受感染的神经元表面，改变细胞内的病毒复制，以便按照非溶细胞机制【6引。感染后，大部分患者的血清和脑脊液中会出现IgM。脑脊液中的IgM抗体在症状出现后的1天后就能被检测到，而9．10天后血清中才能检测到。乙脑病毒特异性IgM抗体在血清或脑脊液中的存在是乙脑病毒感染实验室诊断所必要的【趴】。通过IgM捕获酶联免疫吸附试验(IgM捕获ELISA法)，乙脑病毒特异性IgM已用于乙脑病毒感染患者的临床诊断，在症状出现的几天后抗体类别转换为IgG【821。然而，如果一个人在感染乙型脑炎病毒前已感染登革病毒，由于乙脑与其他黄病毒存在交叉反应性，血清中会出现高滴度的IgGs[83】。在乙脑患者的血清内可以检测到NSl特异性抗体，这种血清对感染JEV的BHK．21细胞具有补体介导的杀伤JEV的作用【84】。被动转移试验表明，抗JEV的单克隆抗体具有保护小鼠不受JEV感染的作用【85,86]。E蛋白是机体中和抗体产生的主要靶蛋白。各种研究已证明E蛋白的不同表位具有引起宿主的免疫反应功能[87,881，重组E蛋白也具有免疫原性【891。1．6．2细胞免疫细胞免疫室保护机体不受黄病毒感染的重要机制。清除感染细胞中的病毒，尤其是神经元细胞中的病毒更加困难，需要通过各种方式来完成。CD8+细胞毒性T细胞(CTL)是清除感染细胞的主要机制，其通过MHCI类识别来消除感染的细胞。而神经元缺乏I类和II类MHC抗原的表达凹-921。因此，淋巴细胞不能直接从各种病毒感染神经中识别受感染的神经元。然而，直到最新所做的研究，大 硕士论丈广西猪JEvFC792分离株全基因序列的涮定与分析磊RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表述部分都用动物模型来了解对对抗乙脑病毒感染的细胞免疫机制，而很少用感染的人类来做研究。研究表明，记忆性T细胞有助于防止继发感染相同或相近的病毒。乙型脑炎病毒感染通过NF．1cB通路诱导典型和非典型的主要组织相容性复合物1(MHC．1)的表达【92】。有报道JEV的NS3蛋白也能引起CD4+和CD8+T细胞反应。据报道，在大多数生活乙脑流行地区的人体内存在NS3的特异性的记忆性T细胞[531OT辅助细胞1(1111细胞)和细胞毒性T细胞(TC)在乙脑病毒感染后渗入小鼠大脑。在小鼠模型中，膜蛋白的结构域III可以引起Thl免疫反应。过继转移JEV免疫的脾脏细胞至14日龄大的小鼠，发现其会产生强烈的CD4+T细胞反应从而保护小鼠不受JEV感染㈣。1．6．3可溶性因子细胞因子是可溶性因子，它是免疫反应的一部分，对抗病毒感染发挥重要的作用。乙型脑炎病毒感染会激活小胶质细胞，转而产生促炎细胞因子女ncox．2，iNOS，MCP．1，IL．6和TNF．Q(731。这导致在中枢神经系统的神经元死亡，神经元的死亡由于小胶质细胞产生的细胞因子的作用，而不是由于乙型脑炎病毒本身引起(Fig．5)。乙脑病毒感染后iNOS的水平仍处于争论中，这可能是由于用于不同研究所用的菌株差异和以及感染复数(MOI)不同造成的【『71】。大脑不同的区域表达不同水平的促炎细胞因子。大脑区域中与记忆和学习相关的海马体，这些炎性细胞因子数量最多，这也许可以解释乙脑幸存者会出现神经系统后遗症【7引。已发现在乙脑患者血清和脑脊液标本中肿瘤坏死因子a的水平都有增加，并与死亡率增加相关【9引。在乙脑病毒感染过程中，肿瘤坏死因子受体(TNFR-1)复合物被激活，特别是在神经元，通过p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和C。Jun氨基末端激酶(pJNK)途径启动凋亡级联【94l，它会导致神经细胞线粒体介导的细胞凋亡。感染巢蛋白阳性干细胞分泌IFN．Y和IL一6激活小胶质细胞和神经胶质细胞。病毒感染的巢蛋白阳性干细胞也产生肿瘤坏死因子．a和CCL．2，这将导致血脑屏障的内皮细胞的细胞粘附分子的上调，帮助招募活化的T细胞和单核细胞进入中枢神经系统【95J。观察发现乙脑病毒感染的患者IFN-1,水平与脑炎后遗症的严重性存在一个显着的负相关。 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达在乙型脑炎病毒感染小鼠脑组织样品中，小胶质细胞分泌的抗炎性细胞因子，IL．10和IL．4减少，这与病毒载量和组织病变程度有关。IL．10预处理的细胞，能够降低白介素1B和肿瘤坏死因子a介导的小胶质细胞COX．2和I的S的产生，并在小胶质细胞活化后抑制神经细胞死亡【96】。蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制剂被认为具有有效控制乙脑病毒引起神经毒性的作用，但是他们并没有影响乙脑病毒的复制。这些都表明细胞因子在JEV弓I起神经毒性中起到重要作用。JEV感染后在中枢神经系统诱导产生趋化因子IP．10和IL．8[97,98】。INF吖在乙脑病毒感染过程中诱导星形胶质细胞分泌IP．10，并在乙脑病毒感染过程中大脑内IP．10逐步增加。虽然其作为一种保护性反应，但IP．10可能会通过引起过度炎症反应以及反应性胶质细胞增生从而导致周围的神经细胞死亡防】。由乙脑病毒引起的，星形胶质细胞和小胶质细胞分泌的趋化因子有助于招募大量的免疫细胞【971。据报道，乙脑严重的疾病和病死率与高水平的IL．8有关【981。1．7乙脑的诊断根据临床病变和流行明显的季节性可对乙脑进行最初的诊断，但仍然需要与其他细菌性、中毒性、病毒性的脑炎疾病相区别。本病由蚊虫传播，流行具有严格的季节性，爆发的时间与蚊虫大量活跃的季节有关，大多数在夏季与初秋，主要集中7、8、9月爆发。临床症状主要以公猪攀丸一侧肿大，母猪繁殖障碍以流产、木乃伊胎、死胎为主要特征。由于混合感染疾病增多，仍需要实验室特异性诊断进行确诊，其中包括常用的病原学和血清学诊断方法、分子生物学检测方法、病毒分离鉴定和免疫细胞化学等方法。1．7．1病原学检测通常可根据乙脑流行病学特点、临床以及病理变化对疑似乙脑的病例作出最初诊断。但要进一步确诊必须结合实验室病原学和血清学诊断。病原学诊断包括病原的分离鉴定和病原的实验室检测，其中诊断本病的最经典方法则是病原的分离和病毒的鉴定。病原的分离：(1)采集临床症状疑似乙脑感染动物发热初期的血液和血清进行病毒分离，动物死亡，则应快速采集体液和脑组织进行分离。以“冷藏”和“迅速”12 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAIlP的建立与E基因抗原域的原核表达的原则进行操作和运送病料。若能在现场接种乳鼠，则能使病毒更易分离。(2)样品处理：将采集的血液可直接用于下步实验，脑组织则需研磨成匀浆后，加入5倍体积的Hank’S液混合成悬液接种动物，经过储存的样品应加双抗(其中每毫升含有1000单位的双抗)在4℃环境中作用4h，2000r／min离心10min，取上清液接种动物或者细胞。(3)分离方法：可采用乳鼠脑内．皮下同时接种或者乳鼠脑内接种后再腹腔接种，尽管乳鼠是比较有效地病毒分离实验动物，但是近年来多采用仓鼠肾原代细胞进行分离，在已经长满单层的仓鼠肾原代细胞中加入培养瓶营养液体积的1／10．1／5的接种材料，吸附30．60min后，加入维持液后置于二氧化碳培养箱中培养，每天对细胞进行观察，连续一周，若发现50％的细胞出现CPE即可收获病毒，若CPE不明显，可继续盲传，待细胞出现有规律的CPE后，取收获的含病毒细胞液接种小白鼠，每日观察发病情况(例如出现离群、不食、消瘦、抽筋等症状)，取有症状的乳鼠的脑进行下一代动物传代接种，如果接种的乳鼠继续发病，可进行病毒鉴定。病毒鉴定：将乙脑病毒分离后，再用乙脑标准毒株和标准血清对新分离的病毒进行全面鉴定，常用的实验包括：交叉中和试验、交叉补体结合试验、酶联免疫吸附试验、交叉血凝抑制试验和小白鼠交叉保护试验。乙脑病原学实验室诊断方法可以对疑似病样的脑组织、体液、胎儿和胎盘中是否含有病毒抗原进行检测。常用的病原诊断方法有：RT．PCR技术、免疫细胞化学法、荧光抗体染色法和反向被动血凝试验。(1)RT．PCR技术(逆转录．聚合酶联反应)：具有高特异、高敏感、高产率、操作简便、易自动化特点，用于病原早期诊断最为有效。1991年Eldadah等研究者将RT．PCR技术开始对黄病毒进行诊断。1993年李刚等建立RT．PCR技术检测JEV核酸，在E基因区段内设计引物，引物上游位于第1788—1806位的基因组碱基序列，引物下游位于1953．1972位基因组碱基序列的，产物大小为185bp，其中引物内含有HindlII限制性内切酶位点，这种方法可特异性的检测JEV核酸。方美玉等(1996)不仅应用RT-Nested．PCR快速诊断出JEV感染，而且将该诊断方法与病毒分离法相比，发现RT-Nested—PCR具有更好的敏感性，不仅直接检测发病早期血清样品或脑脊液内JEV基因，而且检测时间短，在ld内能完成。病毒分离则需要2周才能得到结果。该方法的建立为JEV的早期诊断提供了有力的技术支持。1997年桂卫 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达星等用RT．PCR技术55例乙脑患者脑脊液进行检测，检测时间短，帮助诊治人员及时作出诊断。2001年郭进军等采用一步反转录巢式PCR方法检测乙脑患者脑脊液的病毒核酸，同时运用2．疏基乙醇耐性试验对样品进行检测，发现RT．PCR方法更适合乙脑的早期诊断。(2)免疫细胞化学法：1994年邓艳青等应用单克隆抗体免疫金银染色法检测l7例经ELISA确诊的乙脑患者外周血和脑脊液中的乙脑抗原阳性细胞及表达IL．2，发现该方法对乙脑抗原阳性细胞的检测有高特异性和敏感性，可用于乙脑早期检测。(3)荧光抗体检测法：1983年Kurata等建立用荧光抗体染色法检测福尔马林固定的组织中EJV抗原(经胰蛋白酶处理)，该方法为乙脑的诊断提供新技术。(4)反向被动血凝试验：1987年陈伯权建立乙脑单克隆抗体致敏的羊血球对JEV抗原进行检测，该方法有高特异性、操作简便等特点，可快速诊断乙脑抗原。1．7．2血清学诊断流行性乙型脑炎的诊断多数依靠血清学方法检测患者脑脊液或血清中的乙脑特异性抗体。补体结合试验、2．巯基乙醇法、血凝抑制试验属于传统血清学检测方法，目前血清学检测方法包括：乳胶凝集试验、酶联免疫吸附试验、中和试验、间接免疫荧光试验等。(1)补体结合试验(CT)：该方法的特异性高，常用于乙脑确认。但补体结合抗体很晚，一般出现在发病14天之后，在动物体内维持不超过6个月，又由于大量存在的隐性感染和疫苗免疫，单份血清的测定不能做出确诊。因此必须采集发病早期和恢复期(病后2．3周)的双份血清进行检测才有效。如恢复期血清效价是初诊血清的效价4倍以上，可判定为阳性，说明由JEV引起患者发病。(2)2．巯基乙醇法：参照YamaokaM的判定标准，血清学诊断主要靠特异性IgM的出现及双份血清特异性IgG抗体的4倍增长为依据。IgM抗体水平在正常情况下很低，不能通过胎盘屏障进入胎儿体内。在新生儿中若发现IgM呈现高水平时，可能宫内感染乙脑。因此当机体内出现IgM高水平时，表明近期感染了抗原，诊断时使用单份血清就行。一般应用2．巯基乙醇(B．ME)测定IgM，但是该方法主要是裂解IgM，使其丧失活性。此反应可逆，使用透析袋将清除2．巯基乙醇，恢复抗体球蛋白的活性。此外经70℃加温可将IgM裂解成被抗u14 竺主竺查￡!竺型婴!!竺!竺兰望竺型竺型塑堑型鬯些竺竺苎旦塑苎竺壁竺链抗体捕捉且无抗体活性的亚单位，常用2-ME法或加温破坏IgM，u链捕捉法．ELISA诊断IgM。(3)血凝抑制试验(Ⅷ)：该法最常用于流行病学调查和临床诊断，JEV血凝抑制抗体出现比补体结合抗体早，病后4d．5d已经出现，14天可达高峰期，殷震等发现小鼠接种乙脑后一周出现HI抗体，说明测定HI抗体可作为早期诊断，同时按双份血清判定才能有效。HI抗体包括IgM和IgG，在发病后一周内，可以在患者的血液或脑脊液中检出特异性IgM，IgM体内维持时间短，一般感染乙脑后几周就开始下降，IgG才刚开始出现。因此，鉴定动物HI抗体是IgM还是IgG有着重要的意义。HI抗体若是IgG，则说明动物是早先感染。假如是IgM，则表示动物是近期感染。由于以前HI试验使用的是保存期短的新鲜鹅红细胞，红细胞敏感性又受不同个体的影响，对试验结果的准确性同时也存在影响，该实验对pH要求苛刻，操作复杂，不适用于临床检测和血清学调查中。曹胜文将鹅红细胞醛化后克服HI实验中的不足。1994年立桥等建立的被动血凝试验(PHA)检测人、猪血清中的JEV抗体，为进一步改善HI实验条件提供了新技术。(4)中和试验(NT)：JEV中和抗体出现得比较早，保存时间也长。一般一周左右出现，在体内保存一年以上，因此采取双份血清进行诊断具有重要意义。该方法可在培养细胞。小鼠、鸡胚上进行。在BHK-21细胞上进行中和实验，方法是将10．100TCIDso的病毒0．1mL、各稀释度的待检血清0．1mL和维持液0．8mL混合后养于96孔板，每天观察病变，一般5。6天可知道结果。该方法操作繁复，现在很少应用临床上。(5)酶联免疫吸附试验(ELISA)：现在用于乙脑诊断的有IgM抗体捕捉ELISA(Mac·ELISA)、双夹心ELISA(DS-ELISA)、快速双夹心ELISA(RDS—ELISAl和标记抗原的夹心ELISA(BLA．S．ELISA)。Mac．ELISA不仅除去血清中其他抗体的干扰，而且避免RF干扰。(6)乳胶凝集试验(L虹)：贾杏林等(2000)建立的这种方法，被广泛用来对JE进行流行病学的调查和血清学的检测。(7)斑点金免疫渗滤检测法(DIGAF)：是王祥(2002)建立的具有快速、简便、易操作、重复性和特异性均较好的方法。这种方法被用于JE的快速诊断和血清学的大规模调查。 竺．兰兰兰』!!生婴坚堕丝兰塑坐里竺型竺型墨望堡垒!!二!垒婴!望兰兰皇曼苎!苎墨兰竺堡苎苎兰1．8乙脑的防治黄病毒感染蔓延到新的领域，亟需有效的控制方法加以控制。通常黄病毒的控制方案包括控制蚊子(农药喷洒，浸渍蚊帐)，控制猪群(隔离，屠宰，并接种疫苗)和人类疫苗免疫。JE是一种严重的人畜共患虫媒传染病，我国是世界上JE发病率最高的国家，JE的流行是我国遭受了巨大的经济损失。无论是对我国畜牧业的发展，还是对人类的健康着想，对该病的防制，都具有极其重要的公共卫生学意义。目前没有特效药来治疗JE，只能是对症治疗。由于JE是通过蚊虫叮咬来传播的，所以，JE的主要防制措施是防蚊、灭蚊和接种疫苗。其中，防制JE的关键策略是灭蚊，尤其是三带喙库蚊。但是由于自然状况，根本无法消灭全部的蚊子，而且现在的气候很容易滋生蚊子，根本无法做到消灭一切蚊子。通过灭蚊来控制JE的措施很难得以实施。因此，现在只能依靠接种疫苗来防制JE的传播。猪是JE的主要扩散宿主，饲养周期短，繁殖快，猪群更新快，初次感染JEV时即可引起长达数天的病毒血症，蚊子叮咬带有JEV的猪只，然后叮咬人和畜，从而扩散JE病原，使JE在人、猪、蚊之间流行，因此防止人类感染JEV的重要措施是防止猪感染JE。在JE流行地区，蚊虫开始活动的前一个月(一般是在3．4月份)，用疫苗对JE抗体阴性的猪群或4月龄以上的种猪进行接种，免疫接种配种前一个月的种猪，第一年最好在免疫后2周进行二免，之后每年在蚊虫活动季节开始前(一般是在3．4月份)或配种前接种疫苗一次，立即隔离发病的猪只。1．9疫苗JEV的疫苗早在1930年便开始生产。现已有几种疫苗正在使用，而其他的在研究当中。在过去五十年中，乙脑已得到有效控制，并在日本，台湾，中国和韩国的儿童免疫接种灭活鼠脑源性疫苗方案实施后几乎完全消除【1001。对于处在乙脑风险中的人来说，控$IJJE的未来最重要的措施是疫苗的免疫接。目前，全球使用的JE疫苗主要有三种。这三种疫苗(鼠脑源性灭活苗，细胞培养而获得的灭活苗和细胞培养减毒活疫苗SAl4．14．2)在亚洲的许多地区使用，并取得了一定的成功。16 硕士论文广西猪JEvFc792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达1．9．1鼠脑纯化灭活苗该疫苗是世界卫生组织唯一建议使用的乙脑疫苗。亚洲的田间试验表明，两次免疫(相隔1．2周)可以提供91％的保护率【101J。而对于乙脑流行区的儿童，则需要进行3(0，1和6个月)次免疫。怀孕的妇女和免疫功能低下禁用这类疫苗。由于乙脑病毒株之间很高的交叉反应性，这种疫苗也可以由北京l株增值后灭活得到。这种疫苗疫苗有一些常见的过敏反应，如出现发烧，头痛，全身乏力，头晕，红斑，肿胀和压痛【l021。在接种这种乙脑疫苗后，其皮肤粘膜和神经的过敏反应的频率不同，因此，每年应非常仔细进行这些评估【102】。这种疫苗虽然安全有效，但也有其限制性，如疫苗的成本较高，可用性较差以及缺乏长期免疫力等。1．9．2原代地鼠肾细胞灭活苗这种疫苗由中国研制成功。田间试验表明这种疫苗的免疫保护率为76．90％，并且其副作用小‘1031。VERO细胞培养的减毒SAl4．14．2株灭活后研制成功一种新型灭活疫苗，在实验动物体内能够诱导高滴度的中和抗体。另一个用印度分离株(P20778)在Vero细胞中培养制成的灭活乙脑疫苗已经研制成功，它能够在小鼠体内产生了高滴度的抗乙脑病毒抗体‘1041。许多研究目前正在进行细胞培养程序的标准化，以开发灭活疫苗，从而防止鼠脑中污染物的影响。这些措施包括用叙利亚仓鼠肾细胞(PHK)和Vero细胞分别培养北京3株和北京1株，PHK细胞培养的北京3病毒灭活后被称为P．3疫苗[83，85-87】。1．9．3SAl4．14．2减毒活疫苗一种新的灭活疫苗IC．51，它使用SA．14．14．2乙脑病毒株在Vero细胞中繁殖后灭活而来，已经在澳大利亚，美国和欧洲得到授权批准‘1051。SAl4．14．2减毒活疫苗是由强毒株SAl4致弱而来，中国生产的SAl4．14．2减毒活疫苗目前正逐渐被国际认可，在亚洲地区的使用越来越多，正逐渐取代鼠脑纯化灭活苗。一次免疫就可以在5年内获得96％的保护率。该疫苗成本低，有较好的经济效益，并且被证明是安全和稳定的【1061。在中国，基于在PHK细胞株中增殖的减毒活疫苗SA．14—14．2，1988己JI入我17 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定．号分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达国并自那时以来一直使用至今‘10刀，它最近已被许可使用在印度，尼泊尔，斯里兰卡和韩国。1．9．4其他疫苗其他尝试开发的新型乙脑疫苗，以DNA疫苗的重点。小鼠试验研究表明，编码乙脑病毒NSl蛋白的质粒可以保护90％的小鼠感染乙脑病毒后后不死亡[1081。单次肌注免疫包括乙脑病毒或西尼罗病毒prM和E基因的DNA具有保护小鼠免受感染的作用【1081。使用鼠脑源性福尔马林灭活乙脑病毒进行鼻内／粘膜免疫的方法，已显示出其潜力，但需要有效的佐剂来实现更好的免疫原性ll吲。嵌合减毒活疫苗已经研制成功。它将乙脑病毒SA．14．14．2编码prM和E的基因序列插入至lJl7D黄热病毒的基因组中。嵌合病毒在Vero细胞中培养，已证明其具有高度免疫原性，可以使恒河猴抵抗野生型乙脑病毒脑内和鼻腔内攻毒。活载体疫苗ChimeriVax．JE临床试验中表现出很好的安全性和免疫原性，虽然这种疫苗是由基因III型病毒开发而来，但它能够刺激机体产生保护性抗体来对抗其他基因型乙脑病毒的感染【1101。1．10环介导等温扩增(L创汩)1．10．1背景环介导等温扩增(LAMP)是一种独特的基因扩增法，只使用一种酶就可以实现DNA的等温扩增【lll‘1131。自从LAMP方法的出现，许多研究者已经从不同的角度对其进行研究。因此，目前它正在应用于检测各种临床病原体，如SARS[1141，西尼罗河病毒【115】和牛体外受精受精卵性别的识别【1161。此外，LAMP是具有各种各样特点的基因扩增方法，已被广泛应用于各个领域，包括单核苷酸多态性分型【1171和模板DNA的定量【1181。尤其是，LAMP被认为是用来快速检测基因的有效的基因扩增方法，无论何时何地，都可以用于简单的基因检测。首先，自从LAMP可以等温地扩增基因，使用简单的加热设备就可以进行扩增反应。不需要使用聚合酶链式反应(PCR)迅速控制温度的特殊设18 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LA肝的建立与E基因抗原域的原校表达备【1131。其次，在短时间内(15．60min)可以合成大量的DNA(10．301ttg／251．tL)，同时保持较高的特异性。这一特点极大地方便了LAMP反应的观察【119J。此外，随着LAMP反应的进行，生成了茎环结构，在分子中，LAMP的产物是由一个单链片段组成的。通过使用oligoDNA探针来识别单链片段的序列，扩增后可以在没有热变性的情况下进行杂交检测。这就意味着，所有的流程，从扩增反应到观察反应，都可以在恒温中进行。如果这种独特的LAMP方法得到有效地应用，我们相信，这将有可能开发出简单的基因检测设备，但没有很强的意识，所以尽管知道其必要性，但在广泛的领域，包括传染病的检测、食品检测和环境检测，仍没有实现。关键在于发展简单的设备，将会解决如何简单明了地呈现最终的扩增结果。基因测试被广泛用于检测的病毒和其他致病微生物，突变可能导致人类遗传疾病和遗传倾向的疾病，比如癌症、高血压和其他生活方式相关的疾病。目前，聚合酶链式反应(PCR)1120]方法是最常见用于基因扩增的技术，尽管事实上，操作过程是多和复杂的，需要有一个热循环仪的反应和电泳荧光染料嵌入剂检测扩增产物。另一种方法是实时检测，包括需要荧光嵌入剂的反应和观察荧光反应的方法[121’122】。然而，这些方法仍然需要特殊的技术，只有特定的设施和实验室能用，然而，这些方法仍然作为特殊的技巧只提供给特定的设施和实验室，因为使用可能有毒的荧光嵌入剂或需要特殊的检测设备。最近的一项技术，使用均质系统，可以通过探针进行扩增检测，尽管这需要昂贵的荧光标记探针和检测设备Ⅱ23m61，不符合低成本和易用性的要求。基因扩增的几种替代方法也被开发出来，包括基于核酸序列的扩增【1271，自我维持的序列复制‘1281和链置换扩增【1291。虽然这些方法扩增目的核苷酸的量类似于PCR，但是由于它们需要多种酶和特殊的试剂，没有在其特殊性、简单或有效的有相当大的改善，这些方法不一定是很好的替代品的PCR方法。因此，期待已久的简单化的基因检测在许多领域还没有实现。环介导等温扩增(LAMP)[130]是一种优秀的基因扩增程序，该反应可以在恒温下进行，且只需要一种酶，它快速、简单的特点使它清晰地不同于现有的基因检测方法。LAMP方法使用4个引物，能识别目标DNA的六个区域，这样的特异性非常高(图1)。LAMP方法还能够在不到一个小时，不需要特殊试剂的对DNA进行大量扩增。这种方法既可以用于19 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LA^IP的建立与E基因抗原域的原核表达DNA也可以用于RNA，通过反转录环介导等温扩增(ImLAMP)对靶RNA进行扩增：通过使用AMV反转录，RT和DNA扩增可以在恒定的温度、很短的时间(约60分钟)一步完成【131】。表示检测结果的最重要的问题之一是基因检测的简单化和一般化。我们的目的是建立一个检测系统，在LAMP方法的基础上，使我们可以更容易判别结果。在DNA的扩增中，产生了大量的焦磷酸离子。由于焦磷酸离子可以强烈地与金属离子结合形成不溶性盐类，因此，金属离子的浓度会显着降低【1321。所使用的是金属离子锰，钙黄绿素作为荧光金属指示剂，在LAMP方法检测系统结束后与而价锰离子结合。扩增反应之前，钙黄绿素与锰离子结合，反应淬灭，因此反应液出现橙色。由于LAMP反应中存在靶DNA，认为新生成的焦磷酸盐离子剥夺了钙黄绿素中的锰离子，相反，钙黄绿素与剩下的镁离子结合，产生更大的荧光。另外，当用镍离子和钴离子来代替锰离子时，没有观察到这样的改变颜色。通过结合简单、快速和特异的LAMP方法，我们的检测技术能够呈现非常清晰的结果，我们认为，不仅在医学上，而且应该在对基因检测仍不熟悉的各个领域中应用，如环境测量，农业和食品检测等。1．10．2LAMP方法的原理图6简要介绍了LAMP的反应的扩增机制。该法特别设计了四个靶特异性引物(B3，F3，FIP和BIP)，这是能够识别靶DNA序列的6个不同的区域(Flc，F2c，F3c位于3’端，B1，B2，B3位于5’端；其中F代表上游，B代表下游；C是用来区分互补序列的)。引物F3和B3，是普通的，单一区域的引物，它们分别识别6个位点的其中之一，因此扩增整个靶区域)，双区域引物FIP和BIP，它们都是复合引物，分别能够识别六个位点中的两个，在LAMP反应中起着最重要的作用(相对于引物F3和B3来说，引物FIP和BIP使用过量)。LAMP反应被认为是由具有链置换活性的DNA聚合酶通过两步进行的：起始结构形成阶段(图6b)和循环扩增阶段(图6c)。起始结构的产生需要所有四个引物。正如图6所示，在起始结果形成阶段，内引物(FIP)首先工作，通过BstDNA聚合酶开始复制合成DNA。F2区域退火到靶DNA的F2c区域，并且启动延伸。BIP以类似的方式进行DNA的扩增。接着，外引物F3退火到靶DNA的F3c区域，置换出新合成的DNA链，并且释放出靶DNA。从FIP延伸的DNA20 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析反RT—LA^lP的建立与E基因抗原域的原核表达链被置换和释放。释放的单链在其3’端形成环状结构(结构3)。以单链DNA为模板合成DNA，BIP和B3以相同的方式进行扩增，这一结果导致在两端形成了单链的哑铃状起始结构(结构5)。这种DNA结构是LAMP扩增阶段(只需要两个复合引物就可继续进行扩增)的起始原料(图6c)。在这一阶段，通过自我合成DNA，初始结构转换为茎环DNA，然后FIP杂交，引物链置换合成的DNA，因此生成了与结构5互补的结构7。这意味着循环反应在结构5和结构7之间被建立了。通过延伸和反应的在循环阶段，延伸产物(结构9．12)也生成了。一般情况下，通过DNA聚合酶进行的DNA延伸，会伴随着焦磷酸镁的产生，是一个副产物，由DNTPs释放出的焦磷酸盐离子与反应液中的镁离子结合而成。一个极其大量的DNA，高达400mg／mL，是由于LAMP方法的高效率的合成，导致产生了大量的副产物．焦磷酸盐。由于焦磷酸盐与多种金属离子强烈结合形成不溶盐，LAMP反应过程中可以通过观察反应液中镁离子与焦磷酸盐结合生成焦磷酸镁的白色沉淀来进行检测【1321。然而，视觉检测发现，这种检测系统的信号非常弱，需要更高可辨认性的一般检测方法。 ab‰。繁糍鬣————盛鐾撼。。$·ot搿。。璺圆毒≯'嚣^’嘲l《|毒挲譬—--，：：。-_目自。．，，。，．。，。，。，，。，。．__南。。I_!。。《}|攀#。。摹t甲》烨。一。：。。“彳。‘一—一11。。～孙s_审l墨菇鞣警㈡㈣嘲晕薰璺蜉嚣—纛。一一l。—一一孵’艘酾端嘲—酽嘲■群誊蔼-I一⋯*"一一铷辨删糍⋯f。镶螭翳鞠■鼻粼麟蛳聪斛掣学．瑚越黼娜_群潮．．E黼一勰删。__辗鼎群潮—酵群绻女獬3’。鞠张F1Tar瑟elo黻鼢嚣罄&豢F耗髓舔I器{e8艇驻融陌斋翮毛l匮爱亟函毛量蜜。港一“““““H。。?”了ii。=。篙誊≤秘te§鞲I妒I一擎、⋯。湖I一出laaP嗽I尹鹣警‰。。_。，二鍪飞静掣≮eil≯＼?’，‘驻⋯I：‘一IIIi鸯鎏，乞““‘围豳图6LAMP扩增的原理Fig．6．Principleofloop-mediatedisothermalamplification(LAMP)method．有几种方法来确定溶液中的金属离子的浓度：使用沉淀试剂的重量分析法，滴定法和使用金属指示剂的比色法，使用金属离子火焰光度法的火焰分析法，采用离子选择性电极的电极方法等。其中，测定浓度的分光光度法是用金属指示剂来衡量样品溶液颜色的改变，广泛应用于食品化学、环境分析和生物化学领域，但是还没有被应用于基因检测。钙黄绿素是一种金属指标，与二价金属离子，如钙，镁，形成复合物产生很强的荧光，被使用于各种分析[133-1371。首先，我们LAMP反应液增加了钙黄绿素，我们可以观察到伴随反应液中的焦磷酸镁生产镁离子浓 竺主兰查!!尊3EVFC792分离株全基因序列的测定与分析覆RT-LAMP的建立与E基因抗原域的原援表达度的变化。然而，LAMP反应液中镁离子浓度的减少没有显著引起颜色的变化，用肉眼不足以观察到。因此，我们推测，LAMP反应的过程中，可以通过金属指示剂比色法观察颜色的改变来进行监测，加入锰离子后形成不溶性盐，反应中产生焦磷酸盐，但又被钙黄绿素淬灭。1．10．3LAMP引物设计LAMP引物通常为两对引物，即内引物对(FIP和BIP)和外引物对(F3和B3)，其中内引物FIP由Flc和F2组成，引物BIP则由Blc和B2组成。图7列出了它们在序列中的位置。囫50一I它r2舻匝雨固s，2罗’懿蠡F2tFl奄】‰，孽矿，蔓’，汪4ill窿±l羹j善’_黛—■_-蘑餮黧———■————i誓_——————■·■——·_醚㈣5’5’———●—霸■—■礴黼鳓鳓嘲麟黼嘲黼嬲嘲龋—■—麟《目—_3’蓼3F2IrIBlell2CB3c3_’爨糕5’3趟早羽"nlil‘．a-’堕囹图7LAMP引物设计图Figure76LAMPprimerdesign适当的引物设计是LAMP方法的关键。使用LAMP方法专门的引物设计软件PrimerExplorerV4(http：／／primerexplore．jp／e／)在线设计引物。以下几点是设计引物时需要注意的地方：1)内引物的两端均不能富含AT。2)每个区域的最佳Tm值应该在55．65℃之间。3)5’端的F2到5’端的F1，5’端的B2到5’端的B1应该在40．60个碱基之间。4)DNA扩增区域(从F2到B2)应该不小与200个碱基。5)扩增反应的效率和重复性有引物的纯度有至关重要的关系，建议用高效液相色谱纯化引物FIP和BIP。 硕士论文广西猪JEvFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原謦查兰1．10．4LAMP方法的反应体系和反应条件反应体系：标准的25lxLLAMP反应体系包括：10×ThermoPol缓冲液3此，内引物FIP／BIP1．6pM，外引物F3／B30．2}tM，Betaine0．6mM一1．4mM，dNTPs0．4mM—1．2mM，MgS042mM．8mM，Bst聚合酶大片段8U，模板2斗L，灭菌ddH20补足25I．tL。反应条件：60—65℃，恒温水浴扩增一个小时，80。C灭活10min，彻底终止反应。NorihiroTomita等对LAMP反应进行优化，除在反应体系中加入上述试剂外，还在反应体系中添加钙黄绿素和金属离子锰等，反应前钙黄绿素会跟锰离子结合从而不出现荧光，随着反应的进行，会产生大量的焦磷酸根离子，焦磷酸根离子会跟结合在钙黄绿素上的锰离子结合，钙黄绿素游离出来跟反应体系中的镁离子结合便会出现绿色荧光，这种可视化检测方法的建立，避免了反应结束后再添加化学染料，既简化了操作，又减少了污染的可能性。1．10．5LAMP反应产物的鉴定由于LAMP反应产生了大量副产物焦磷酸盐，可以与反应液中的M92+结合，生成不溶性白色沉淀焦磷酸镁，因此，可以根据反应后有无白色沉淀的生成来判断是否发生了反应。因为不用添加EB等有毒有害物质就可判断结果，大大提高了实验的安全性。由于LAMP特有的核酸扩增机制，它的扩增产物是由花椰菜状的DNA和多重复靶序列的茎环状DNA共同组成的混合物，因此在琼脂糖凝胶电泳上会出现LAMP特有的阶梯状目的条带。此外，反应结束后，还可以在反应产物中添加SYBRGreenI，通过肉眼观察溶液颜色的改变来判断反应结果，从而达到快速、简便鉴定结果。或者在反应体系中添加钙黄绿素和锰离子，即可在反应结束直接观察是否出现绿色荧光来判定反应结果。1．10．6LAMP检测方法的特点依赖于LAMP方法所其特有的反应机理，其具有以下几个独有的扩增特点：24 竺圭兰查—望兰!兰!竖792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LAYuP的建立与E基因抗原域的原棱表达1)反应温度恒定：不需要预先将双链DNA进行的热变性，整个扩增反应均在恒温下进行。2)高效、快速地扩增：扩增时间15．60分钟，扩增效率即可达到109_1010个拷贝数。此外还可用通过使用环引物来提高扩增效率，最高的可比原来节约50％的时间。3)特异性高：使用能识别靶DNA6个区域的四条引物，所以理论上讲其特异性极高。4)低成本：不需要昂贵的PCR仪等仪器，只需恒温水浴锅或其它温度稳定设备就可以进行反应。5)高灵敏度：10拷贝或更少的扩增模板即可进行扩增。1．10．7LAMP的应用由于LAMP相较于其他的检测方法，有其显著的优点，如操作简便简便、反应快速高效、特异性强以及廉价等，自NotomiT于2000年发明了LAMP方法以来，许多研究人员就对LAMP不断地进行研究，并逐步应用于临床疾病诊断、食品安全以及动物胚胎系别鉴定等各个领域。1．10．7．1临床疾病的诊断LAMP法已经应用到了动物和人类各种疾病的诊断，包括细菌病、病毒病和寄生虫病。Song等‘138l用以肠侵染性大肠杆菌和贺氏杆菌所共有的特异性基因ipaH基因为靶基因，设计LAMP引物进行LAMP扩增，因为LAMP反应过程中会产生大量的白色焦磷酸镁沉淀，因此可以用比浊仪对反应结果进行判定。Maeda等【13卅在LAMP反应的基础上，反应结束后在反应液中添加SYBRGreenI，就可以通过观察反应液中颜色的改变来判断反应结果，从而建立了可视化检测。NorihiroTomita等对Maeda等‘139】建立的可视化检测进行优化，在反应体系中添加钙黄绿素和金属离子锰等，反应前钙黄绿素会跟锰离子结合从而不出现荧光，随着反应的进行，会产生大量的焦磷酸根离子，焦磷酸根离子会跟结合在钙黄绿素上的锰离子结合，钙黄绿素游离出来跟反应体系中的镁离子结合便会出现绿色荧光，这种可视化检测方法的建立，避免了反应结束后再添加化学染料，既简化了操作，又减少了污染的可能性。25 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗堡苎竺堡竺苎兰兰1．10．7．2农业生产白斑综合征造成虾养殖业巨大损失，其病原白斑综合征病毒可以使虾发病，在3．7天内即可使虾的死亡率达到100％。除此之外，引起的鲶鱼肠败血病的爱德华菌是鲶鱼养殖面临的重要致病菌。因此，对于这些病原菌的检测什么重要，也有多种分子生物学方法可以检测这些病原菌，如最为常用的PCR方法、更为敏感的巢式．PCR等等。巢式．PCR虽然具有较高的特异性和敏感性，但其缺点是用时长，一般一次诊断至少在8小时以上。Yeh等‘1401建立LAMP方法，检测爱德华菌的特异性基因eipl8，在65。C反应1h即可完成扩增反应，检测的灵敏度达到20CFU。Fukuta等利用LAMP方法检测黄叶卷曲病毒，成功检测出西红柿黄叶卷曲病毒；并将其与普通PCR反应进行比较，发现LAMP的灵敏度是PCR的100倍。1．10．7．3食品检测Ohtsuka等‘1411建立了鸡蛋中是否残留沙门氏菌的LAMP方法检测，结果表明LAMP方法的检出率比PCR方法和培养计数法的检出率高。110份沙门氏菌阳性样本中，LAMP方法检出率是100％，而PCR方法检出率为90．9％。1．10．7．4胚胎性别鉴定Iirayama等【142】建立了快速检测牛胚胎性别的LAMP法检测方法。共设立两套LAMP引物，建立两个LAMP反应体系，其中一个体系根据雌雄胚胎所共有的特异序列来设计LAMP引物，另一个则根据牛Y染色体特异序列来设计LAMP引物。当两个LAMP反应的结果均为阳性，则所选的胚胎的性别为雄性；如果只有根据雌雄共有特异性序列设计的通用引物的LAMP反应为阳性，则说明检测胚胎性别为雌性。这种基于雌雄胚胎性别染色体基因序列的不同而建立的LAMP鉴定胚胎性的检测方法，敏感性强、准确性高，一般取3个细胞样本检测LAMP检测，若检测结果一致，即可以很准确地判别性别。整个包括DNA提取、LAMP反应以及结果判定在内，共计用时不超过1．5小时，切结果的判断可以根据其生成的白色沉淀来进行浊度分析。 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LA肝的建立与E基因抗原域的原校表达1．11研究目的与意义JE是一种严重的人畜共患病，而猪是JEV主要的贮存、增殖和扩散的宿主，并且通过蚊虫叮咬来传播给人类。对人类而言JEV可引起严重的脑炎，并且伴随着严重的神经后遗症；对养猪业而言，它引起母猪出现流产、死胎等繁殖障碍，导致公猪产生一侧性睾丸肿大的睾丸炎等，从而严重影响了人类健康和养猪业的发展。随着科技的进步，广西养猪业的规模化养殖的不断扩大，生猪生产位居全国第八，猪只饲养量大，更新加快，为JEV的扩大传播提供了有利的条件。因此，需要有快速、灵敏度高而准确的诊断方法来防制本病。而广西目前基于核酸序列的JE检测方法，多多少少都还存在着检测时间长、敏感性差、操作复杂、需要比较昂贵的实验设备等缺陷，而LAMP方法以其等温、快速、高效灵敏、特异性强等优点解决上述缺陷，并且对于RNA病毒，只要在扩增DNA的基础上加上逆转录酶就可以实现RNA的一步扩增，因此对JEVRT-LAMP方法进行研究，以期能够建立操作简单、成本低廉、快速诊断的检测体系，适合基层推广和现场、即时检测；在厄病原的快速检测方面将具有实用价值。广西研究猪JEV的报道甚少，也尚未有广西猪JEV分离株全基因序列的报道，因此对广西猪JEV分离株FC792进行全基因序列扩增、克隆、测序，通过与国内外JEV毒株序列进行分析比较，在确定该毒株的遗传变异情况的同时，也丰富了广西猪JEV分离株全基因组序列信息库。目前，尚未有治疗JE的药物，只能靠接种疫苗来防制JEV的感染。而现在猪用疫苗的毒株来源于人，使得人类JE疫苗免疫猪存在较大争议。因此对猪JEV广西分离株FC792E基因含有抗原域I、II基因(E。)的克隆、原核表达以及免疫原性研究，为研制出一种适合在猪群中使用的安全、有效的JEV基因工程疫苗打下良好的、科学的基础。 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAIIP的建立与E基因抗原域的原核表达第二章研究内容研究一广西猪JEVFC792分离株全基因序列的克隆、测定及分析1主要材料、试剂与仪器1．1菌种、毒株及载体毒株：JEV广西分离株FC792，为2011年1月采集自广西防城港某猪场母猪流产胎儿脑组织，经3日龄鼠脑接种3代后，再接种到BHK21细胞上，盲传三代获得，经RT-Nested—PCR鉴定为JEV阳性。菌种：E．coliDH5。为本实验室保存；载体：PMD．18T，为Takara产品。1．2主要试剂M—MLVReverseTranscriptase：Promega公司RibonuclEaseInhibitor：TaKaRa公司限制性内切酶：HindIII、BamHI、SalI，购自大连宝生物DNA凝胶回收试剂盒：武汉摩尔太dNTPs、RNATrizol、DrEamTaqDNA聚合酶、小量质粒抽提试剂盒：购自上海生工AgaroseB：Biobasic公司DNAMarkerDL2000：南宁科迪生物技术有限公司DNAMarkerDM2000：南宁恒因生物氯仿：天津市北方天医化学试剂厂产品异丙醇：天津市博迪化工有限公司产品无水乙醇：成都市科龙化工试剂厂产品DEPC：上海捷瑞生物工程有限公司 硕士论文广西猪JEvFC792分离株全基因序列的测定与分析覆RT-LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达EB替代染料：北京普利莱基因技术有限公司TaqDNAMixture：天根生物1．3主要仪器设备精密移液枪一套、离心机(Eppendorf公司)、48孔双槽PCR反应仪(伯乐)、凝胶成像系统(天能)、恒温摇床、恒温培养箱、漩涡振荡器、DNA水平电泳槽(北京六一)、水浴锅等。1．4引物的合成和序列的测定由南宁恒因合成引物，由上海生工完成序列测定1．5主要试剂和培养基的配制1．5．1常用培养基的配制LB培养基：将lO．Og氯化钠(NaCl)、5．09酵母提取物(yeastextract)、10．09胰蛋白胨(tryptone)放入1000mL锥形瓶中，加入适量去离子水，使之完全溶解后定容至1000mL，用IOM氢氧化钠(NaOH)调节pH值为7．2，分装、包扎封口，121℃高压灭菌15分钟。LA培养基：将2％琼脂粉加入到LB培养基中，微波炉加热，使之完全溶解，包扎封口，121℃高压灭菌15分钟，自然冷却至50"C左右，于操作台无菌倒制成固体平板。1．5．2DNA水平电泳缓冲液的配制1)7×TBE储存液的配制：准确称取Tris75．69、硼酸38．59，加入0．5MpH8．0EDTA28mL，用去离子水定容至1000mL。2)O．7XTBE工作液的配制：将7XTBE储存液稀释10倍即为工作液。1．5．3制备感受态细胞所使用的试剂的配制1)100mM／LMgCl2"20．339MgCl2．6H20，1000mL去离子水，完全溶解后29 121℃高压灭菌15分钟。2)100mM／LCaCl2：1．119无水CaCl2，1000mL去离子水，完全溶解后3)甘油溶液：2．8mL灭菌甘油，17．2mL100mM／LCaCl2，混匀后即可，4℃存放。2实验方法与步骤2．1引物的设计使用Primer5．0和oligo6．0进行引物设计，详见表2—1。表2-1JEV全长扩增引物Table2．1ThesequenceandpositionofprimersforJEVfulllengthamplification引物名称引物序列碱基位置片段大小Nmneofthepl’briersSequalceoftheprhnersLocationPl‘oductsI崩lgthJl-Fn．RJ2．FJ2．RJ3．FJ3．R】4-FJ4．RJ5-FJ5．RJ6．FJ6．RY7．F5’．GAGAAGTrr盯CTGT(玎GAA．3’5’．TGAeAACTGTTCCaTGACCA．3’5’．CaGaAAOGGAAaCATTGA-3’5’．aCaGAAOGOAGCAACTG．3’5’．GrGCTGrCGCAGrr(KTCCC．3’5’．CAGGAAAAGGATCCGTGGIT．3’5’．CAAGGTaGAj疆1．AaGGGAGG-3’5’．AGGGCTTATCAGCGTTCrrG．3’5’．TOaCGGrGmCTC盯CTG-3’5’．GCCGTGCTCCATTaATTCT．3’5’．CTTCGGAGGTG∞CTAGT·3’5"-aCTCAACGGCTTTGGTAAC．3’5’．AGAAAGCCCTCAGAACC-3’1．191928．19471301．13183419．34353410．34195570．55895516．55357646．76656862缶8708929-89478279-829610683．1070l10558．106041947bp2135bp2180bp2150bp2086bp2423bp”．R5’-AGATCCTGTGTTCrTCCT-3’10959·10976419bp2．2样品的准备FC792第三代细胞毒，反复冻融3次，40C、8000rpm离心5min，取上清用于RNA提取。30 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原校表达2．3RNA的提取及反转录RNA的提取方法同研究一2．4。反转录251xL体系：RNA209L，5xBuffer51xL，引物(随机引物18T)llxL，2．4目的基因的扩增2．4．1PCR扩增dNTPs2此，M-MLVReverseTranscriptaseO．51aLRibonuclEaseInhibitor0．59L。a25ttL反应体系：eDNA59L，10xtaqBuffer2．5pL，dNTPs0．5pL，上游引物0．5pL，下游引物0．59L，taq酶0．259L，加灭菌去离子水至25pL。bPCR程序：详见表2-2。表2-2JEV全长扩增PCR反应程序Table2．2TheprogramsofJEVfunlengthPCRamplification引物名称预变性变性退火延伸Prhncrs111t111ePredenatureDenatureMmealF_x'tendJl95℃7111in95℃45s60℃45s72℃2nm‘lJ295℃71nin95℃45s60℃45s72℃2mt‘nJ395℃7mm95℃45s58℃45s72℃2mm‘J495℃7111i1195℃45s60℃45s72℃2mnllJ595℃7nlill95℃45s57℃45s72℃2mhlJ695℃7mhl95℃45s56℃45s72℃3mt‘n"95℃7nml95℃45s59℃45s72℃hnhl2．4．2PCR产物电泳与DNA凝胶回收将配制好的7XTBE电泳液稀释成0．7倍的TBE工作液，量取0．7倍的TBE电泳液50mL，称取琼脂糖0．69，微波炉加热溶解，待冷却至50。C左右时，加入11．tL的EB替代液，混匀后倒制成琼脂糖凝胶。取PCR产物10pL上样，用O．7×TBE缓冲液作为电泳液，100V电泳约3l 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LA押的建立与E基因抗原域的原核表达30min；在紫外线凝胶成像系统中观测目测条带，切下目的条带，按照凝胶回收纯化试剂盒上的说明书进行目的基因的DNA回收与纯化，纯化产物．20℃储存备用。2．5目的基因克隆2．5．1DH5a感受态细胞的制备：1)挑取少量菌株至LA培养基中划线培养12．16h；2)挑取单个菌落接种于4mLLB培养液中，37。C200转恒温振荡过夜(12．16h)：3)配制100mM／LCaCl2、100mM／LMgCl2各100mL，甘油溶液20mL，高压灭菌；4)取2)菌液2mL于100mLLB培养液中，200转37。C恒温振荡培养3h；5)将4)菌液分装于4个大离心管中，25mL／管，冰浴5分钟，4。C3000转离心3分钟，沉淀细菌；6)将离心后的菌液的上清液倒掉，12．5mL冰浴制冷的100mM／LMgCl2重悬细菌，3000转4。C离心3分钟，沉淀细菌；7)倒掉上清液，12．5mL冰浴制冷的100mM／LCaCl2重悬细菌，冰浴20分钟，4。C3000转离心3分钟，沉淀细胞；8)倒掉上清液，2．5mL冰浴制冷的甘油溶液重悬细菌，分装到1．5mLEp管中，1009L／管；9)4"C过夜后，．804C保存备用。以上操作均在无菌条件下操作。2．5．2目的基因与pMD-18T克隆载体的连接连接体系：pMD-18T载体1．01．tL，目的基因5．0laL，SolutionI4．01xL，共10}tL体系。4。C连接过夜，取出后直接用于转化。2．5．3转化1)取出感受态细胞DH5n，冰浴溶解，约10min。32 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析反RT—LA盱的建立与E基因抗原域的原棱表达2)取连接产物lOI．tL，放入感受态细胞中(1001．LL／管)，轻轻吹匀，冰浴30min。3)42。C水浴热击2min，期间要保持水浴锅内的水不能晃动，水浴完后取出EP管，立即冰浴5mira加入370C预热的LB培养基5001xL，200rpm、37℃恒温振荡1h。4)取150肛L菌液与20txL200mg／mL的氨苄西林钠在EP管中混合后，用无菌三角玻棒铺菌器将其均匀铺于LA平板上。5)将铺菌的LA平板于37。C正放2h待菌吸附后，将LA平板倒置，培养16．24h。6)将生长良好，较为大、圆、透的疑似阳性白斑挑出，接种至LB培养基中(含1001xg／mL氨苄西林钠的)，37。C，200rpm恒温培养10—16h。2．5．4质粒抽提与酶切鉴定质粒抽提按照质粒提取试剂盒的说明进行；酶切鉴定：将提取的质粒进行双酶切鉴定，体系为一对限制性内切酶0．3此，通用酶切Buffer1．0pL，双蒸灭菌水3．4lxL，提取的质粒5．0I．tL，共计10此的酶切体系，37。C酶切过夜；取5“L的过夜酶切的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并观察结果。2．6序列测定和分析将酶切鉴定正确的样品，送往上海生工进行序列测定；测序回来的序列用DNAstar中Seqman进行序列拼接，得到FC792的基因组全序列，运用DNAstar中的Meglin进行核苷酸和氨基酸同源性分析，运用MEGA5．0构建遗传进化树。序列分析和构建遗传进化树中参考的序列见表2．3。 硕t畸仑文广西猪JEVFC792分离糠全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达表2—3所参考的JEV毒株核苷酸序列的详细信息Table2-3ThedetailedinformationofreferencesequenceofnucleotidesofJEVstrainIshikawaRP——2msJEV——AT31K94P05JaoArS982GP78P20778TCFUCH2195LATIPlSAl4——14——2SAl4—12—1—7JKT6468SA-14Kvl899SH一5302-29K87P39HwThCMAr4492JE——KK——R8819941985200519941998197819581999199520002001200319601999200120021987199819922004JapantaiwanJapanKorEaJapanIndiataiwanAustraliaTaiwanChinaIndonesiaChinaKorEaChinaKorEaChinaTaiwanThailandAB051292AF014160ABl96923AF045551AF069076AF075723AF080251AF098736AF217620AF221499AF254453AF315119AF416457AYl84212AY243842AY316157AY555757AY555762AY585242AY849939D45362DQlll786，Ⅲ●ⅢmⅢⅡⅢⅣm●Ⅲ●23456789加n呓埒M坫坞"掩均加俎毖 硕士论文广西猪JEVFC792分离糠全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表这35 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达3结果与分析3．1JEVFC792株全长基因序列的分段扩增结果使用合成的JEV全长基因的分段扩增的7对引物J1．J7，运用RT-PCR对FC792进行全基因的分段扩增，分别扩增出长度约为1947bp、2135bp、2180bp、2150bp、2086bp、2423bp、418bp7个目的片段(图2-1)。12345678图2—1FC792全基因的分段扩增产物——2000bp-500bpFig2—1FC792breakdownsofthegeneamplificationproduct1-7：7段分段扩增产物；8．MarkerDL20001-7-sevenperiodofsectionamplifiedproduct；8-MarkerDL2000；36 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原较表达3．2重组质粒酶切鉴定结果用BamHI和SalI进行双酶切鉴定，7个重组质粒均切出两条片段，分别与pMD-18T载体和预期目的基因大小一致(图2—2)。12345678500bp——+图2—2FC792全基因重组质粒酶切鉴定结果Fig2-2DigestionidentificationresultsoftheFC792allgeneticrecombinantplasmids1-MarkerDL2000；2-8：7个重组质粒酶切结果；1-MarkerDL2000；2—8：TheDigestionidentificationresultsofthesevenrecombinant3．3JEVFC792株全基因序列的比较分析3．3．1FC792株全基因序列情况将测序正确的7段序列用DNAstarSeqman软件进行拼接，得到JEVFC792株的全基因序列。FC792株全长10977个核苷酸，其中3’非编码区有586个核苷酸，5’非编码区有95个核苷酸，开放阅读框从96位至10391位，共计10296个核苷酸，共编码3432个氨基酸。基因组的第96．2477位核苷酸编码结构蛋白，其中96．476位核苷酸编码衣壳蛋白C，477．977位核苷酸编码膜蛋白M，978．2477位核苷酸编码囊膜蛋白E； 硕士论文广西猪JEvFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达基因组2478．10391位核苷酸分别编码非结构蛋白NSl、NS2、NS3、NS4和NS5，具体见表2．4。表2—4JEVFC792基因组信息Table2-4ThegenomeinformationofJEVFC7923．3．2FC792株与国内外代表毒株的核苷酸和推导的氨基酸同源性分析将FC792株与NCBIGenBank上登录的覆盖JEV4个基因型的部分国内外代表株的全基因序列进行同源性比较，分析发现，核苷酸同源性在84．6％．99．7％之间，氨基酸同源性在96．2％．99．4％之间；其中，与疫苗株SAl4．14—2和YUNNAN0901(分离自云南2012年3月)株核苷酸同源性为99．7％和99．6％，氨基酸同源性为99．4％和99．2％；与JKT6468核苷酸和氨基酸同源性最低，分别为84．6％和94．5％(详见图2-3、2-4)。FC792株与国内外代表株E基因核苷酸同源性在86．4％．99．7％之间，氨基酸同源性在94．6％．99．2％之间；其中，与疫苗株SAl4—14—2和YUNNAN0901核苷酸同源性为99．7％和99．5％，氨基酸同源性为99．2％和98．8％；与JE．KK．R88核苷酸和氨基酸同源性最低，分别为86．4％和94．6％(图略)。FC792株与国内外代表株prM／M基因核苷酸同源性在82．1％．99．8％之间，氨基酸同源性在90．5％．99．4％之间；其中，与疫苗株SAl4．14．2株Ⅵ聃NAN0901株核苷酸同源性为99．8％和99．6％，氨基酸同源性均为99．4％。与2003年印度分离株JKT6468的核苷酸和氨基酸同源性最低，分别为82．1％和90．5％(图略)。 FC792株与国内外代表株C基因核苷酸同源性在85．3％．100％之间，氨同源性在81．2％一100％之间；其中，与疫苗株S苷酸同源性为100％和99．7％，氨基酸同源性为A14．14．2株YUNNAN0901100％和99．2％。与JKT6468酸和氨基酸同源性最低，分别为85．3％和81．2％(图略)。基酸株核核苷FC792株与国内外代表株非结构蛋白NSl基因核苷酸同源性在88．7％-99．7％之间，氨基酸同源性在93．3％．99％之间；其中，与疫苗株SAl4．14．2株和YUNNAN0901株核苷酸同源性为99．7％和99．5％，氨基酸同源性为99％和98．8％；与Ishikawa株核苷酸同源性最低，为88．7％，与JKT6468株氨基酸同源性最低，为93．3％(图略)。FC792株与国内外代表株3'-UTR基因核苷酸同源性其中，与疫苗株SAl4—14．2和YUNNAN0901核苷酸同源与JKT6468株核苷酸同源性最低，为91．5％(图略)。8岳e里凸Percentldentity在91．5％一99．1％之间；性为99．O％和99．1％，'23456789101112131415161718t9201l■I99099799484697198．198689098．296597289．090．598．199．188497．39T99701FCl922nI|■■■■|g叠699494697198．189．789098．296597299．190．598．198．088497397"99702YUNH^N09013030．4—■I99．684．79729B．388．789198．396697．399．196．698．2B8697．498097．138^1．-14．24060．604l■■184797398．388．999296496797409296．799．398．3B8．697．599．19724S^14-12．1·7517717717617．6l■I84784983．593295184794483．904684985．08348488498475JI(r646863030292817．6—■l97．488．889．097490790189395697397．388．696497．499'6·beijin口．171．91．e1．717．327■■I89189．496．396．897．1e9．496．398．299．189．997199．39737P3812612．612512．419．3124121●■I96g89188．788790008289099．097．698889．08878lshikawa912．212111g19．612．2”．732I■●Bg‘88．989089608．699．389．396．999089．38909姻4P05t0181g1．71617．12．61812'”BI■一96．997189696599799．798g97498．397l10Ja棚9821136363534176343．312．51233．2—■■95789．195．196890．日89．696．096．9997'1P2077812282．82726180●129126122294．5l■l柏．795．797097．0985963970962120P78'3'2．2112112011918711811．7”011411．5121126l■●朗．g99．409789．289489013FU14363635341784．538132127365．1451，3l■■I96498．388195．996．295714CH2195L^152．01．日17。17．32．81．912．2”8033．33．1”．739—■●99．988．897．399297315CHl392'62020191817．3281912．2118033．33．1”．73801■■■88997399197316T1P11712912912712．619．41271242．53212312712g11413412412．4—■■88．688．808617}州8991828282．726’743．73012412127423811g432e2812．7I97_1993t8K87P391922．1201732．607122’17183231117．3．9191912．43．0—■■973'gHw卸313．130281760．928125'227340124．5282812．7382e■■●20ling12345678glO1'121314151617'81口20图2．3FC792株同乙型脑炎代表毒株全序列核苷酸同源性分析Fi92-3NuleotidehomologyanalysisofJEVFC792straincompletegenomicsequencewithotherrepresentativeJEVstrains39 硕士论文广西猪JEVFC792分离糠全基因序罗Ⅱ的测定与分析及RT—LAMP的捆口乞与E基因抗原域的原核表达PercentIde嗍l'2345678910111213141516171819抽'l■_992÷gg498g981986984968981986；96996．g9839889459869629639809801FC792208l■■99499098398798596998398797．09709859899459879639649812、，uNN^N09a13060．6l■l99298498898697098498897198699094698B9649669829823SAl4．14．2411．00．8l■■9B6990988973986990974{974988992948991967969905i9854S^14-12·1·751．g1．81．714I99098997598799097697698g9929509929679709949865beijing-161．4131．21．0l■1993977990999978978992997；953995l970972{98g9896CHl39271．615141．210．7—■■97598899397697699499495099．29699709879867P38323028252425l■197497797697697497894497g9779799739748Ishikawa91．g1B1714131012，7●■_ggn9769769889929519919689699869869CH2195L^10141312101001072410l■■9789789929979539959／"097398998910T1P1113．23029262●22．5252．52．2l■■100．097698094698．0968959974975l'1FU12323029262425252520．0l■■976980946980968969974975120P78131．7161．41210．B0．6261．20．8242．4疆■一99495099296日97O98798613HW141．21'110|0808030．620．8032．00．6l■I954997972974991¨；JaoArS982155．75．6545．2495．2585．049565．65147l■l95593e93994995015Jl(T646B16141．31．2O90．80．50．82．209052．00．8034．7l■■971973990gg016K87P39t7403．83．7343．3313．224331329652．9l■一972966967171<94P05183．B3．63．5323．12．g3．12．2322．8323．23127642．729-i96B96918IO'1899'口211．91．8160．61．113；2．81．4126261．309531．03533—}98519Ling加201918151．41．1142．714126261409521．033．115l■_20P207781234S67B910111213141516仃181920图2—4JEVFC792株与其他代表毒株全序列氨基酸同源性分析Fi薛-4AminoacidhomologyanalysisofJEVFC792withOtherrepresentativeJEVstrains3．3．3JEV基因进化树的构建与分析将FC792全基因、prM／M基因、E基因、NSl基因和3’端非编码区与NCBIGenBank上登录的覆盖JEV4个基因型的部分国内外代表株(详见表2—3)的相应基因一起，使用软件Mega4．0进行系统进化树的构建，均以一株墨累山谷脑炎病毒MEV为外群。结果显示，在得到的5条进化树中，FC792株均属于基因III型，与疫苗株SAl4．14．2株和YUNNAN0901株最接近，同在一个小分支上(详见图2-5)。∞uc∞已∞兰3 硕士论文广西猪jEVFC792分离株全基因序列的测定与分析反RT—LAMP的爿口乞与E基因抗原塌t的原板毒邀●FCT旺seq▲YI●N卟∞们．seq▲SAl4-14-ZseqSAl4-12-1-7．seqGF'78．seqI-tNseq随seq由呐圈眨3田O-11311Z,ss]TIPl．seqF'20778．seq啪1．skiL吨seqKS"／P39．seqO-t'l蝴R上9eq]ⅡKgtP05．seq1州I阻s田IIM巍明jJ(16档蚓]ⅣMvEseqⅢ●FCT旺seq▲YI●N^-嘲们．seq▲SAl4,-14．-ZseqSAl4-12-1-7．seqG078．seqt-INseq1=3,seq由曲r滩s圜O-113吃．seq11P1．seqP20"／'R．seq．．berg-1．seq晦seqKBTP38．seqO-212ZA．seqFu潮]111a4P05．seq]啪∞a跚lIM鼬明j,KR468．seq]IVMUEseq^咿18∞Z卿JEV．．AT'J1seqRxamt9帕TIPl．seq1P-．seqSA-14．seqI-IVVseqP3．seqP20778．seq融靳叫seqUV删▲YIJN"劂．朝●FCT92．aeqSAl4-12-11-7．seq▲．弘14-14．2．．seqCH21韬LA．seqGP'／8．seqFU,seq]Ⅱ煳∞＆9q]蛙^№钢I1№—嘲JJcm●∞．s∞-1IVMEV．seqⅢ曼量萝二r篇引～倒 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达Iff百守—书F—高—可守—前F—志广1怎1——1守—百}—1}—1守—1}1图2—5FC792和国内外代表毒株遗传进化分析Fi薛-5AnalysistheevolutionaryandgeneticsofFC792andotherrepresentativeJEVStrainsA：全基因；B：E基因；C：C基因；D：PrM基因：E：NSl基因：F：3’-NTRA：genome；B：Egene；C：Cgene；D：prMgene；E：NSlgene；F：3’-NTR3．3．4FC792株与疫苗株SAl4．14．2株核苷酸和氨基酸差异性分析猪乙型脑炎病毒广西分离株FC792株与疫苗株SAl4．14．2株共有39个核苷酸差异，核苷酸总体差异率为0．36％。其中3’端非编码区的基因的差异率最大为1．19％，5’端非编码区和衣壳蛋白基因的差异性最小为0。5’端非编码区含95个核苷酸且与SAl4．14．2的同源性为100％，3’端非编码区有7个核苷酸的差异，且在10701位有1个核苷酸的插入，与疫苗株的差异率为1。19％。开放阅读框共有10296个核苷酸，共有32个核苷酸差异，差异率为0．31％，其中编码结构蛋白基因共仅有4个核苷酸差异，差异率仅为O．17％，编码非结构蛋白的基因共有28个核苷酸，差异率为0．35％。编码结构蛋白的基因中以E基因的变异率最大为0．20％，编码非结构蛋白的基因中以NS5基因的差异率最大为0．63％(表2．5)。氨基酸的总体差异个数为22，差异率为0．64％。结构蛋白仅有2个氨基酸差异，差异率为0．25％，结构蛋白上的2个氨基酸差异均为E蛋白的差异(表2．5)，FC792株E447为甘氨酸，而疫苗株则为天冬氨酸，为非保守性差异；FC792株42等==黑黑了挈嬲三剖≯ 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析反RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达E466为缬氨酸，而疫苗株则为丙氨酸，为保守性差异。疫苗株SAl4．14．2与野毒株SAl4相比，E蛋白区域有10个氨基酸的差异，其具体位点分别为E107、E138、E176、E177、E244、E264、E279、E315、E439和E447，分离株FC792除E447与强毒株SAl4同为甘氨酸外，其余9个位点均与疫苗株SAl4．14．2相同。E138、E176、E315、E439位点氨基酸在乙脑病毒强毒株SAl4减毒过程中起最重要作用，分离株FC792在这4个位点均与疫苗株SAl4．14．2相同(图2—6)。表2-5乙型脑炎FC792株与疫苗株SAl4．14．2的差异性分析Table2··5GcnomeanalysisoftheJEVFC792comparedwithSAl4··14·-2stains43 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达￡!￡＆￡!§!￡￡!{!￡±§!±!：!!§!}!E2§；§z§§§12l!；§21￡!E!{!}￡￡§±￡!S￡!}!!±§!!￡§￡：!＆E￡￡!：g￡{1．，一1％坚苎竺三竺竺翌Ir￥C‘0t《te}fIt0▲{#^t■，●IV‘l#》$#l芎l■●■§#t'‘》t^#l■lt^{tI▲lV#STet■^ltt女l§t￥▲冀C}t芎0t^，C摊ZjF■‘l6■#■P#r：E6^SO▲t■，口‘VLt‘§{C‘flt^■》t，T■■，■■I■zE^；e■^￡，tjTeTI▲sVTtZsTV^RC，TT0￡^砒}l舢2l，，C‘6t{i#々，ll0^$0^t#￥§‘t‘l6#S￡‘曹lt^■p￡，t‘■，t#l●!l^$e‘▲#vt#了CYt^$■，#；}tt^RC’7，O￡^赫●●女!．1．E￡§￡il；!!lg±!!§￡}!§!三!!￡￡l§￡§§￡!￡§§￡；￡i!￡§l￡81{§!￡!{￡!l!￡；!!§!!!!§§!l￡!!§±§12黝wl计*mI¨mt∞l∞m札j■lRR^≯s}Tf‘#q‘rTp■s■§t#c罐Fp§t#llD{c^Kf=eTsE^l‘R罩lI}#■lx，lEp#lF■-#TTT$l■■#暮■，^口，f牲徽eIH■￡Kt▲§#tT’￡t0事，彳々t；≮§簟$c纠f弦{‘##l》tc^t，sctlE^l0tt，t}￡tiKt毽p$trvE#t?tsl篝t#■tt^O，0阜鞋●一I}2tI■ltEt^}s#T，#E々#rTpR###■#e哪#E#jl■fe^Er；cT；E^l#RTl々}#■l《T—r#lF，■‘Tff#‘Ile■T}^qf§枞4±§g±±§!{!：￡!§￡§!±≥￡；l￡!￡l!：§2S￡!￡!￡≥!!E{￡!!Ei=2§5{￡§：§g§!￡Bg}±§￡!=l：￡；!§!￡§￡§§§}Miqi，羹l艄i∞抽口：埔：坤：辅：袖ln^s0^^2，7vT}■●，硼vil工x‘0DfeI，7I}clf^s#‘■f￡^，'vttv$srtr‘’t^t，r■’‘^‘’，，，’，sT^tit^EL‘l摊榄i‘i^}t^^#，f，f}，^}}I!^仙t‘0pTetttl，clti0‘L，，t^rtt■彳v§#‘；，‘，ttl■rH■‘^l，■f#ts●T^’RItl‘‘■‰¨如2j6■^，口▲^x，TP'fl^，s-Iz‘##T#￡■TIpc￡’i{‘‘l7f^rT，■Tve#R，r‘fEt￡，，H》‘▲l'■74，l’T^■P，■￡‘‘l挑l●‘ii￡r￡0^■^ttO，■v^L‘j0t##LEE▲‘‘0▲i々，ETss，tIt0#tlRcAI￡*#RI‘‘E6tf'‘EcT￡Krsr^r■rt●tGI6勘，虻王碍mm％●≈0tnr订鞲F秭隋r扣百Fil焉了荫瞄i订藕F订隋T☆T订隋了弱嘲☆百罚^百订百言丽百r订忑可卉了丽斤了订膏i力蓐T币节彳再彳黼2札￡『畸c“■^TE0svv^‘03口z‘#t琏^睡L^G^zYv{，55s艟■弘Tl0HtEc女‘z*}gl^‘￡#，tt#lct￡trsr^z■魂，》TG■6s扯●一lI．2：越#¨■^#^¨々s￥V^¨}tt¨‘謦‘“^lt}l￥¨5镬‘t¨簟lRct‘≮羹》#‘^§“tf，t¨tt鼙¨“‘。瓣t¨#蛳·善．篡篡SS．§耋毒0—0暑点jJ■I篡毒—Ik尊童00b童毒j革0L芏{j0已兰喜jlL羔羔{0；!毒j：耋耋．苎．曼熹，骗k篡。￡羹，蔓33。赫善，主王羔，j臻童赫童；荨毒3，摅纛三摹萎妻尊觏】·“舒堂型銎黧銎翌登竺站lT，，lt‘；，}‘#■6，cEj，I■3■^sL■■|T，7‘l‘■T，，rr，^T0：^●#t￥t￥￡tz}，r6》47lTv‘Rc§#●l，■l■tR^#拜撇藏lt■，l￡l，Ts#s女#，‘#I’l■$f鼻l‘鼙☆算彳，f#il#t，■，r，^，}0^■#t，‘￥￡t￡}fr#》stlfv#R口e#tl■■i■iR^#蛳4-l}；嚣lT■■Z￡‘j了##；垂‘，￡‘Ill，5甲^；‘■e矗T，，#R‘，Ti，tf，^TsS^■，E蕈；，l矗l，，r#■iTIT，‘t6DllZ■#l■矗暑^‘戳●￡三§￡兰§￡￡!：§圣￡主l￡566；￡曼z±要2E￡!{￡!!!曼￡l18e!曼i!￡量￡±￡S兰§￡￡§签§!l}l!§曼￡±§＆＆荨l!zl±￡!曼!{勘，。n锋豢需雨熏黧曩露黧焉需需蔫霖蔼麝需黧纂飘丽勰群t一柏lsT‘‘t^t，tt‘墨c^々^‘^^‘#9t^■缸#4#l##■r，$lq■^v■t’t目6恤F■下‘，‘#*，■ltq‘ztq女JI‘I■#e#l^#t女#'置^l●^‘^P‘^T6‘，■trt^T■Vg^脚·“罐图2．6FC792与SAl4．14．2及SAl4氨基酸比对Fi薛一6Ali印memof也ededucedE锄inoacidofFC792w．thSAl4-14-2andSAl4Strains3．3．5FC792株和Ⅵ烈NAN0901株核苷酸和氨基酸差异分析核苷酸和氨基酸同源性比较及遗传进化分析都表明JEVFC792株和Ⅵ瓜附AN0901(2012)株的亲缘关系非常接近。猪乙型脑炎病毒广西分离株FC792株与Ⅵ小NAN0901株共有49个核苷酸差异，核苷酸总体差异为0．45％。其中3’端非编码区的基因的差异率最大为1．20％，非结构基因NS3差异性最小为0．1l％。两株的5’端非编码区均为95个核苷酸，仅有1个核苷酸的差异，：差异率为1．05％，3’端非编码区有6个核苷酸的差异，FC792在10701位有1个核苷酸的插入，差异率为1．20％。开放阅读框共有10296个核苷酸，共有42个核苷酸差异，差异率为0．41％，其中编码结构蛋白基因共有8个核苷酸差异，差异率仅为0．34％，编码非结构蛋白的基因共有36个核苷酸，差异率为O．45％。编码结构蛋白的基因中以E基因的变异率最大为0．40％，PrM／M基因的差异率最小为0．20％；编码非结构蛋白的基因中以NS2基因的差异率最大为O．79％，NS3基因的差异率最小为O．11％(表2．6)。 硕士论文广西猪JEVFC792分离栋全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗同u式的原核表达表2-6乙型脑炎FC792株与YUNNAN0901株的差异性分析Table2·6GenomeanalysisoftheJEVFC792comparedwithYUNNAN0901stains氨基酸的总体差异个数为26，差异率为0．76％。非结构蛋白有21个氨基酸的差异，差异率为0．76％，其中以NS2蛋白的差异率最大为1．36％，NS3的差异率最小为0．16％；结构蛋白有5个氨基酸差异，差异率为0．63％(表2．7)，其中衣壳蛋白上有1个氨基酸差异，E蛋白有4个氨基酸的差异，这5个差异位点中有2个为保守性差异，3个为非保守性差异(表2．7)。表2-7乙脑病毒FC792株与YUNNAN0901株结构蛋白中氨基酸差异情况Table2．7TheAminoacidsubstitutionsofJEVstructuralproteinsbetweenFC792andYUNNAN0901strains45 硕士论文广西猪JEVFC792分离捆‘全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达4讨论1935年于日本从脑炎患者脑组织内分离到第一株JEV，自此之后在亚洲大部，澳大利亚等国家和地区不断从人、蚊子、猪、马等中分离到不同基因型的JEV。我国于1935年开始流行JE，并于1938年首次通过血清学调查证实JEV在我国流行，1940年在北京首次分离到乙型脑炎病毒。目前JEV已在我国大部分地区流行，疫苗接种虽然有效的减少了发病人数，但目前我国的乙脑患者仍占全球发病人数的80％，这可能与我国同时流行基因III型和基因I型JEV以及人．蚊子．猪互相传播密切相关。JEV的进化分析以全基因最为可靠，但难度较大，需进行全长的序列测定，不利于快速对流行毒株进行遗传进化分析。JEV目前的进化分析方法主要有两种；一种是依据prM基因的部分核苷酸序列进行基因分型；另一种则是以全部E基因进行JEV分型。依据JEVprM基因部分序列的分型方法可以将JEV分为四个型，而依据JEVE基因的分型方法则可以将JEV分成5个基因型，分离与新加坡的Muar株属于基因V型。以prM基因部分序列作为分型的依据，由于其序列短，所以分型的结果往往不十分可靠，具有可变性，而以E基因作为分型依据则普遍被认为具有代表性。王环宇、李晓宇等利用E基因作为分型依据，发现在我国首次分离JEV后的很长时间内，流行的毒株均为基因III型，代表毒株如Beijing．1、P3、SAl4等，2004年后相继在多省分离到基因I型JEV，但仍仅在蚊虫中流行。乙脑也是给养猪业带来巨大危害的重大动物疫病之一，有调查表明猪乙脑的阳性率非常之高。据1996年的调查，调查对象为云南省19个县的所有育肥猪，其乙脑阳性率为40．11％，而对北京地区的调查则发现猪乙脑的阳性率达100％。李茂宁于2008至2009年采集广西贺州、玉林等12个市的1676份猪血清进行JE抗体检测，发现阳性为923份，其阳性率高达55．1％。本研究中用到的JEVFC792株，是2011年从防城港地区的猪流产胎儿脑组织中分离得到，设计JEV特异性引物，对FC792株进行分段扩增、序列测定和软件拼接后得到JEVFC792全基因组序列。JEVFC792株全长10977bp，其中5’ 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAlIP的建立与E基因抗原域的原棱表达非编码区长为95bp，3’非编码区长为586bp，开放阅读框从96位至10391位，共计10296个核苷酸，共编码3432个氨基酸。基因组的第96．2477位核苷酸编码结构蛋白，其中96．476位核苷酸编码衣壳蛋白C，477—977位核苷酸编码膜蛋白M，978．2477位核苷酸编码囊膜蛋白E；基因组2478．10391位核苷酸分别编码非结构蛋白NSl、NS2、NS3、NS4和NS5。本研究分别以全基因、C基因、prM基因、E基因、NSl基因和3’端非编码区为分型依据，与国内外覆盖JEV4个基因型的代表毒株分别构建遗传进化树，记过表明，分离株FC792株与SAl4—14—2、YUNNAN0901、Beijing和P3株等在同一个大分支，证明FC792属于基因属于基因Ⅲ型，且与SAl4．14．2和YUNNAN0901株的遗传进化关系最为接近。本研究所采用的以全基因、C基因、prM基因、E基因、NS1基因和3’端非编码区为分型依据所构建的6个遗传进化树，均能很好的将四个基因的JEV准确的划分，以全长和E基因为分型依据最为准确。将FC792株与NCBIGenBank上登录的覆盖JEV4个基因型的部分国内外代表株的全基因序列进行同源性比较，分析发现，核苷酸同源性在84．6％．99．7％之间，氨基酸同源性在96．2％．99．4％之间；其中，与疫苗株SAl4．14．2和YUNNAN0901(分离于2009—2010年)株核苷酸同源性为99．7％和99．6％，氨基酸同源性分别为99．4％和99．2％，说明分离株FC792和疫苗株以及YUNNAN0901株的亲缘关系比较接近。2009在新疆分离到的乙型脑炎病毒XJ／08／01也属基因III型，且与疫苗株SAl4．14．2的核苷酸同源性也达到99．6％，2009—2010年在云南分离到的乙型脑炎病毒YI删AN0901株与疫苗株SAl4．14．2株的核苷酸同源性也高达99．6％，氨基酸同源性达99．4％。除此之外，李茂宁等报道2010年于广西分离到的GP株和LC株E基因与疫苗株的核苷酸同源性分别为99．7％和99．8％。这些报道与本研究的结果相似。FC792株、XJ／08／01株、YUNNAN0901株、GP株以及LC株等，近年来报道的分离株很多与疫苗株SAl4．14．2的同源性很高，这是非常值得注意的一个问题，这促使我们必须对用SAl4．14．2减毒株作为疫苗接种猪群的安全性或免疫效果进行重新评估。本研究将FC792株同与其遗传进化关系较近的YUNNNAN0901株进行了核苷酸和氨基酸差异性分析。FC792株与YUNNAN0901株共有49个核苷酸差异，47 硕士论文广西猪JEVFC792分离捌I全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的奠泣与E基因抗原域的原核表达核苷酸总体差异仅为O．45％；氨基酸的总体差异个数为26，差异率为0．76％。结构蛋白仅存在5个氨基酸的差异，其中衣壳蛋白上有1个氨基酸差异，囊膜蛋白有4个氨基酸的差异，膜蛋白没有氨基酸差异。在这5个差异位点中有2个为保守性差异，3个为非保守性差异。FC792与YUNNAN0901分离时间接近、核苷酸和氨基酸的高同源性、遗传进化树上同属一个小分支以及0．45％的核苷酸差异率都表明FC792株和YUNNAN0901有着很高的亲缘关系。广西与云南为邻省，相距较近，可能通过媒介的迁徙造成跨省传播；且随着交通的日益方便，两省互相引猪的现象日渐频繁，这有可能导致JEV同一毒株在广西和云南两省的猪群同时流行。鉴于FC792和YUNNAN0901均与SAl4．14．2同源性很高，是否可能均来源于疫苗株，有待进一步的研究。5．1本研究为广西首次完成了对猪JEV分离株的全基因组序列测定，JEVFC792株基因组全长为10977bp，其中5’非编码区长95bp，3’非编码区长586bp，开放阅读框从96位至10391位，共计10296个核苷酸，共编码3432个氨基酸。5．2JEVFC792株与国内外代表毒株核苷酸同源性在84．6％．99．7％之间，氨基酸同源性在96．2％．99．4％之间；与疫苗株SAl4．14．2和Ⅵ．小烈AN0901(分离自云南2012年3月)株核苷酸同源性为99．7％和99．6％，氨基酸同源性为99．4％和99．2％。5．3遗传进化分析表明JEV广西分离株FC792属于基因ⅡI型，与疫苗株SAl4．14．2和YUNNAN0901株的遗传进化关系最为接近。 硕士论文广西猪JEVFC792分离栋全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的奠口乞与E墓因抗原塌‘的原核表达研究二皿VRT．LAMP检测方法的建立与初步应用1材料1．1试验材料猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪流行性腹泻病病毒(PEDV)均由本实验室保存；临床样品包括：猪母猪流产胎儿脑组织、种公猪精液、蚊子，于2010年9月至2011年12月采集于广西各地猪场；SAl4．14．2减毒活疫苗，购于成都中牧实业股份有限公司。1．2主要试剂引物的合成：南宁恒因生物工程有限公司dNTPs：上海生工生物工程有限公司DNAMarkers：南宁科迪生物技术有限公司Tirzol：上海生工生物工程有限公司氯仿：天津市北方天医化学试剂厂产品异丙醇：天津市博迪化工有限公司产品无水乙醇：成都市科龙化工试剂厂产品DEPC：上海捷瑞生物工程有限公司RibonuclEaseInhibitor：TaKaRa公司M-MLVReverseTranscriptase：Promega公司AgaroseB：Biobasic公司EB替代染料：北京普利莱基因技术有限公司SYBRGreenI荧光染料：购自北京Solarbio公司甜菜碱：购自南宁恒因生物工程有限公司MgS04：Promega公司BstDNA聚合酶大片段：newEngland公司49 硕士论文广西猪JEVFC792分离捌‘全基因序列的澳I定与分析及RT—LAMP的翻臼乞与E基因抗原域的原核表达TaqDNA聚合酶：上海生工生物工程有限公司PBS-购自南宁恒因生物工程有限公司1．3主要仪器离心机(Eppendorf公司)电热恒温水槽(上海齐欣科学仪器有限公司)电泳仪(北京市六一仪器厂)电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)超低温冰箱(ThermoForma公司)(核酸、蛋白浓度)分光光度计(TheⅡ110Forma公司)电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司) 硕士啼e文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的触与E基因抗原域的原核表达2方法与步骤2．1试验路线[二≯2．2引物设计参照GenBml_k上登录的JEVSAl4(U14163)E基因序列，通过PrimerExploreV4在线软件设计针对JEVE基因6个位点的两对特异性LAMP引物，所有引物都经NCBIBLAST序列分析。包括内引物FIP(Flc+F2)、BIP(Blc+B2)，6'b弓l物F3、B3两对引物(见表2．8)。表2-8引物序列参数Table2—8Parametersoftheprimersused5l 硕士论文广西猪JEWFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达2．3病毒RNA的提取提取前样品的稀释：用2mL灭菌PBS稀释一瓶猪乙型脑炎减毒活疫苗(SAl4．14．2)。①取稀释好的JEV疫苗毒1601．tL于1．5mL的EP管中，加入400I．tLTrizol，盖上EP管，反复颠倒15次充分混匀，室温放置8min；②打开EP管盖子，快速加入1409L氯仿，剧烈震荡15s，室温放置4min；③12000rpm／min4℃离心10min；④小心吸取上清2759L至另一新的EP管中，加入2759L的异丙醇，充分混匀，．20℃放置10mira⑤12000rpm／min4℃离心10mira⑥小心倒掉上清，加入75％的酒精4009L，沿壁旋转；(D8000rpm／min4℃离心3min，弃上清，置50。C烘箱烘干EP管中的IⅢA；⑧加入用DEPC处理过的无RNA酶的水169L溶解IⅢA；⑨即用或一80℃冻存备用。2．4反转录一环介导恒温扩增反应(IH．L—WP)251xL标准反应体系：l0xThermoPoldNTPsMgS04(100mM)Betaine(10M)FIP(25mM)BIP(25mM)F3(25mM)B3(25mM)M—MLVReverseTranscriptaseBstDNA聚合酶大片段RNA去离子水补足259L523p,L29L39L31aL0．89LO．89L0．2pL0．29L8U2．51．tL 硕士论文广西猪JEvFC792分离糠全基因序列的测定与分析及RT—LAIdP的建立与E基因抗原域的屎棱表达充分混匀，快速离心，于热恒温水槽中65。C，水浴lh，80。C，10min终止反应。2．5琼脂糖凝胶电泳2．5．1制胶(2％)①于电子天平称取lgAgaroseB置锥形瓶中，加入50mL的0．7xTBE，于微波炉煮沸120s；②自然冷却至50。C左右，加入29L的EB替代染料，充分混匀；③用15孔小梳子倒制凝胶，室温放置20min，使凝胶充分凝固。2．5．2电泳①将环介导恒温扩增产物(8“L／孔)加至琼脂糖凝胶的孔中，同时加入DNAMarker作对照；②100v电压，直到电泳带跑到凝胶块的2／3处；③于凝胶成像系统上观察结果并拍照。2．6RT-LAMP反应条件的优化为了在特定的JEV检测中保证RT-LAMP最佳反应体系和反应条件，有必要对RT-LAMP反应体系进行优化。因此将M92+、Betaine、dNTPs、引物的浓度和反应温度、反应时间，作为主要的优化对象。2．6．1反应温度的优化根据引物Tm值，将温度按55、58、60、62、65、68。C依次递增，重复多次，以确定最佳反应温度。具体操作步骤为：按照标准的RT-LAMP反应体系加样，随后分装到7个0．2mL无菌EP管中，1．6管在55、58、60、62、65、68℃这6个温度之间变化，第7管为阴性对照(65℃)，对应温度水浴1h，之后80。C力H热10分钟，2％琼脂糖凝胶，8“L扩增产物，110v电泳30min，以出现清晰典型的梯状电泳带为最佳结果。 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LA衄的建立与E基因抗原域的原核表达2．6．2反应时间的优化为了在最短时间内得到准确的检测结果，反应时间按15、30、45、60、90、120min这6个时间进行依次递增，并且多次重复，以选定最佳的反应时间。具体操作步骤为：按照标准的RT-LAMP反应体系加样，随后分装到7个0．2mL无菌EP管中，1．6管在15、30、45、60、90、120min这6个反应时间之间变化，第7管为阴性对照，65℃，水浴1h，之后80℃加热10分钟，2％琼脂糖凝胶，81xL扩增产物，110V电泳30min，以出现清晰典型的梯状电泳带为最佳结果。2．6．3dNTPs浓度的优化将dNTPs的浓度按0、0．2、O．5、0．8、1．0、1．2、2．OmmoYL依次递增，重复多次，选定最佳dNTPs浓度。具体操作步骤为：按照标准的RT-LAMP反应体系加样，随后分装到8个0．2mL无菌EP管中，1．7管在O、O．2、0．5、0．8、1．0、1．2、2．0mmol／L这7个浓度之间变化，第8管为阴性对照，65℃，水浴1h，之后80℃加热10分钟，2％琼脂糖凝胶，81xL扩增产物，1IOV电泳30min，以出现清晰典型的梯状电泳带为最佳结果。2．6．4Betaine浓度的优化实验中将Betaine按0、O．1、0．2、O．5、1．0、1．5、2．0mol／L依次递增，重复多次，选定最佳Betaine浓度。具体操作步骤：按照标准的RT-LAMP反应体系加样，随后分装到8个0．2mL无菌EP管中，1—7管在O、O．1、O．2、0．5、1．O、1．5、2．0mol／L这7个浓度之间变化，第8管为阴性对照，65℃，水浴1h，之后80oC力H热10分钟，2％琼脂糖凝胶，81xL扩增产物，110V电泳30min，以出现清晰典型的梯状电泳带为最佳结果。2．6．5MgS04浓度的优化试验中将MgS04按0、l、4、8、10、20mmol／L依次递增，重复多次，来 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原棱摩述选定最佳MgS04反应浓度。操作步骤如下：按照标准的RT-LAMP反应体系加样，随后分装到7个0．2mL无菌EP管中，1-6管在0、1、4、8、10、20mmol／L这6个浓度之间变化，第7管为阴性对照，65。C，水浴1h，之后80℃加热10分钟，2％琼脂糖凝胶，8此扩增产物，llOV电泳30min，以出现清晰典型的梯状电泳带为最佳结果。2．6．6引物浓度的优化内引物FIP(BIP)的浓度会明显提高反应体系的扩增效率，外引物F3(B3)的浓度也会影响反应的效率，试验中将外引物浓度固定为0．2mmol／L，FIP(BIP)按0、0．2、0．4、0．8、1．6、3．2mmol／L依次递增，即内引物与外引物的比为0、1：1、2：1、4：1、8：1和16：1以此递增，重复多次，用以选定内引物和J'F弓I物的最佳浓度比。具体操作步骤如下：按照标准的RT-LAMP反应体系加样(试验中将外引物浓度固定为0．2mmol／L)，随后分装到7个0．2mL无菌EP管中，1-6管为内引物FIP／BIP浓度在0、0．2、0．4、0．8、1．6、3．2mmol／L这6个浓度之间变化，即内引物与外引物的比为O、1：l、2：l、4：1、8：1和16：1，第7管为阴性对照，65℃，水浴1h，之后80℃加热10分钟，2％琼脂糖凝胶，8此扩增产物，110V电泳30min，以出现清晰典型的梯状电泳带为最佳结果。2．7RT-LAMP特异性测定提取猪圆环病毒(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、JEV、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病病毒(PEDV)的核酸，利用优化好的反应体系进行RT-LAMP的扩增。对扩增产物进行凝胶电泳，并在凝胶成像系统上观察实验结果来检验RT-LAMP方法的特异性。2．8RT-LAMP敏感性测定提取JEV疫苗株(SAl4．14．2)的RNA,用紫外分光光度计测(OD260nm)定其含量，然后用DEPC水进行1／10倍比进行10个系列稀释，按照建立好的 硕士论文广。西猪JEVFC792分离期L全基因序列的测定与分析及RT—Lm毋的爿臼乞与E基因抗原域的原核表达RT-LAMP反应体系来进行扩增。同时用本实验室建立的JEVRT-Nested．PCR方法进行扩增，以对比JEV-RT-LAMP的敏感性。以电泳结果出现阳性反应条带的模板用量的最高稀释倍数来计算可检出的最低JEV-RNA量，测定RT-LAMP方法的敏感性。2．9RT-LAMP的稳定性检测用同一模板进行3次扩增，以验证LAMP的稳定性。2．10运用RT-LAMP对临床样品进行检测利用本实验室建立的JEVRT-Nested．PCR和建立好的JEVRT-LAMP方法对40份公猪精液、60份母猪流产胎儿、两份蚊子样品和本实验室分离的4株JEV进行扩增，分析扩增结果，来验证建立的RT-LAMP方法的可靠性。2．11RT-LAMP反应结果的可视化观察结束RT-LAMP扩增反应后，在产物中加入100×SYBRGreenI染料1“L，充分混匀后观察溶液颜色的改变，并把加入染料后的溶液放在紫外光下观察是否有荧光产生。 硕士啼套文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原翊【的原枝表达3实验结果与分析3．1JEVRT-LAMP反应温度的优化结果图2．7表明，扩增产物能在退火温度为60．65。C之间产生目的梯状带，且在65。C产生的梯状条带最为明显，低于等于58。C或高于等于68。C均没有扩增产物的形成。因此，将最优反应温度定为65℃。图2．7反应温度的优化结果●——一2000bp+一一250bpFig2-7TheresultofreactiontemperatureofLAMP1．55℃；2-58。C；3．60℃：4．62℃；5—65℃；6—68℃；7．阴性对照；8-MarkerDL20001-55*C；2．58。C；3·60℃；4．62。C；5-65。C；6-68。C；7-Negtivecontrol；8-MarkerDL200057 硕士荫?文厂’西猪JEVFC792分离株全基因垮；列的测定与分析及RT-Lm舻的建立与E基因抗原域的原核表达3．2JEVRT-LAMP反应时间的优化结果图2．8表明，反应时间为60min开始，用电泳的方法可以观察到目的梯状带，并且随着时间的增加，扩增产物的量增加，反应时间低于60min时，用电泳的方法检测不到扩增产物。为了节省检测时间，将反应时间定为60min。●一一2000bD+一一250bp图2．8反应时间的优化结果Fig2-8TheresultofreactiontimeanLAMP1．15min：2-30min；3-45min；4-60min；5-90min；6—120min；7．阴性对照；8-MarkerDL20001—15min；2-30min；3-45min；4-60min；5-90min；6-120min；7-Negtivecontrol；8-MarkerDL2000 硕士论文广西猪JEVFC792分离楝全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达3．3JEVRT-LAMPdNTPs浓度的优化结果图2-9表明在没有dNTPs的情况下，用电泳的方法没有检测到扩增产物的形成，当dNTPs的浓度为1．0mmol／L时，电泳的目的梯状带最清晰，其它浓度时，从电泳条带分析来看没有明显的区别。因此，将dNTPs的最优反应浓度定为1．0mmol／L。l234567892000bp250bp图2-9dNTPs浓度的优化结果Fig2-9TheLAMPreactionresultuseddifferentconcentrationofdNTP1-0mMdNTPs；2-0．2mMdNTPs；3-0．5mMdNTPs：4-0．8mMdNTPs；5．1．0mMdNTPs；6．1．2mMd1、ITPs；7．2．0mMdNTPs；8．阴性对照；9-MarkerDL20001-0mMdNTPs；2-0．2mMdNTPs；3-0．5mMdNTPs；4-0．8mMdNTPs；5．1．0mMdNTPs：6-1．2mMdNTPs；7-2．0mMdNTPs；8-Negtivecontrol；9-MarkerDL200059 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT_LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达3．4JEVRT-LAMPBetaine浓度的优化结果图2．10表明在不添加Betaine的情况下，利用电泳的方法也能检测到扩增产物，而且各浓度之间，从电泳条带情况分析，没有明显差别，但是Betaine浓度在0．5mol／L时，目的电泳梯状带最清晰。因此，将Betaine的最优反应浓度定为0．5mol／L。123456789图2．10Betaine浓度的优化结果电泳图Fig2-10TheLAMPreactionresultuseddifferentconcentrationofbetaine1-0MBetaine；2-0．1MBetaine；3-0．2MBetaine；4—0．5MBetaine；5．1．0MBetaine；6一1．5MBetaine；7-2．0MBetaine；8一阴性对照；9-MarkerDL2000l·0MBetaine；2—0．1MBetaine；3-0．2MBetaine；4—0．5MBetaine；5．1．0MBetaine；6—1．5MBetaine；7-2．0MBetaine；8-Negtivecontrol；9-MarkerDL2000 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达3．5RT-LAMPMgS04浓度的优化结果图2．11表明，当镁离子浓度低于4mmol／L时，电泳时没有形成目的梯状带，说明过低的M92+浓度没有发生LAMP反应；当M92+浓度为4-20mmol／L时，用电泳的方法可以检测到LAMP的扩增产物，而且这几个浓度都可以得到的明显的梯状条带，其中M92+浓度为10mmol／L时，目的梯状条带最为清晰；因此，将MgS04的最优反应浓度定为10mmol／L。图2-llMgS04浓度的优化结果Fig2—11TheeffectoftheconcentrationofMgS04usedonLAMPreaction1-MakerDL2000；2-0mMMg+；3-1mMMg+：4-4mMM92+；5-8mMM92+；6．10mMM92+：7．20mMM92+；8．阴性对照；1-MakerDL2000：2-0mMM92+；3-1mMM92+；4．4mMM92+；5-8mMM92+；6．10mMM92+：7-20mMM92+：8-Negtivecontrol；6l 硕士论文，。西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LmlP的建立与E基因抗原域的原核表达3．6RT-LAMP引物浓度的优化结果图2．12表明，在没有内引物(FIP／BIP)的情况下，利用电泳的方法没有检测到扩增产物，在内引物与外引物之比为2：1、4：1、8：1、16：1时可以检测到扩增产物，并且随着内引物与外引物之比的增大，检测到的扩增产物的量也增加，当FIP(BIP)／F3(B3)为8：l时，电泳已经可以得到清晰明亮的梯状带，而当内夕t-弓I物的比值为16：1时，得到的电泳条带最亮，但梯状条带不如8：1时典型。因此，将最佳内引物与外引物之比定为8：1。2000bp图2．12内外引物浓度比的优化结果电泳图Fig2-12EffectofdifferentratiobetweeninterprimerandouterprimeronLAMPreaction1—0；2．1：1；3-2：1；4-4：1；5-8：1；6．16：1；7．阴性对照；8-MakerDL20001—0；2-1：1；3-2：1：4-4：1；5-8：1；6-16：1：7-Negtivecontrol；8-MakerDL2000 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达3．7JEVRT-LAMP检测方法各反应条件的优化经过对JEVRT-LAMP反应的M92+、Betaine、dNTPs、引物的浓度和反应温度、反应时间的优化，并且综合各方面的因素，最终确定RT-LAMP反应体系中各组分的浓度为FIP／BIP各1．6mmol／L，F3／B3各0．2mmol／L，dNTPs为1．0mmol／L，Betaine为0．5mol／L，M92+为10mmol／L，BstDNA聚合酶大片段8U，M．MLVReverseTranscriptase8U，10×ThermoPol3此，RNA2．5I．tL，去离子水补够251xL；65℃，反应1h，接着80℃10min终止反应。3．8JEVRT-LAMP特异性测定提取PCV2、PRV、JEV、CSFV、PRRSV、PEDV的核酸，利用优化好的反应体系进行RT-LAMP的扩增，结果只有JEV的扩增结果为阳性，其余的对照病原均为阴性，如图2一13所示。图2．13RT-LAMP引物特异性检测结果电泳图Fig2—13ThespecifityofusedRT-LAMPprimers1-PCV2；2-PRV；3-JEV；4-CSFV；5-PRRSV；6-PEDV；7．阴性对照；8-MarkerDL20001-PCV2；2-PRV；3-JEV；4-CSFV；5-PRRSV；6一PEDV：7-Negtivecontrol8-Marker 硕士截?文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达3．9JEVRT-LAMP敏感性测定结果分别用优化好的RT-LAMP反应体系和本实验室建立的JEVRT-Nested．PCR来扩增，结果显示I弭L√wP可以检出0．5pg的眶VRNA(图2．14)：RT-Nested．PCR扩增的目的片段大小为228bp，其检测极限为O．5pgRNA(I蜀2—15)。说明RT-LAMP的扩增结果与RT-Nested．PCR的一致。1234567891011图2．14RT-LAMP敏感性试验结果电泳图2000bp250bpFig2-14ThedetectionlimitofexactRNAusingRT-LAMPreaction1．10一；2．1o-2；3．10一；4．104；5．10～；6．10正；7．10．7；8．10一；9．10一；10．阴性对照；11．MakerDL20001-lO～；2-10之；3．1o-3；4．10’4；5．10～；6．1矿；7．1o-7；8．10一；9．10-9：10-Negtivecontrol；11．MakerDL2000600bp200bp123456789图2．15RT-Nested．PCR敏感性试验电泳图Fig2-15ThedetectionlimitofexactRNAusingRT-Nested-PCRreaction1-MakerI600；2-总RNA；3-10～；4-10～；5-10。：6-10‘4；7-10～；8-10。6；9-10-71-MakerI600；2-undilutedRNA；3-10一；4-10一；5-10一；6-104；7-10一；8-10石：9-10。764 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达3．10JEVRT-LAMP的稳定性检测结果用已经优化好的JEVRT-LAMP方法对相同的RNA模板进行3次扩增，结果表明3次的扩增结果无明显差别(图2—16)。2000bp250bp图2．16RT-LAMP稳定性检测结果电泳图Fi薛-16ThestabilityoftheRT-LAMPl一第一次扩增产物：2．第二次扩增产物：3．第三次扩增产物；4．阴性对照；5-MakerDL20001-ThefirsttimeRT-LAMPproducts；2-ThesecondtimeRT-LAMPproducts；3-ThethirdtimeRT-LAMPproducts；4-Negtivecontrol；5-MakerDL200065 硕士。沦文广’西猪JEVFC792分离糠全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达3．11JEVRT-LAMP临床样品检测结果结果用RT-LAMP方法诊断为阳性的种公猪精液有10份、母猪流产胎儿脑组织18份、蚊子样品0份和实验室分离的JEV4株，阳性检出率为28．3％(图2．17)；用RT-Nested．PCR方法诊断为JE阳性的种公猪精液有12份、母猪流产胎儿脑组织18份、蚊子样品0份和实验室分离的JEV4株，阳性率为31．1％(图2．18)；两种方法检出率的符合率为90．9％，具体见表2．9。表2—9RT-LAMP与RT-Nested-PCR检测方法的比较Table2--9ComparationtheresI．tLtsbetweenRT-LAMPandRT-Nested·-PCR123456789101l12131415图2．17RT-LAMP部分临床样品检测结果Fig2-17PartaildetectionresultsofclinicalsamplesbyRT-LAMP1：阴性对照；2．7：临床样品1-6；8：MarkerDL2000；9-15：临床样品7．131：Negtivecontrol；2-7：clinicalsamplesI-6：8-MarkerDL2000；9-15：clinicalsamples7—1366 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达l23456789101112131415图2—18RT-Nested．PCR部分临床样品检测结果Fig2-18PartaildetectionresultsofclinicalsamplesbyRT-Nested-PCR1：阴性对照：2-8：临床样品1—7；9：MarkerI；10．15：临床样品8一131：Negtivecontrol；2—7：clinicalsamplesl-6；8-MarkerDL2000；9-15：clinicalsamples7—133．12RT-LAMP反应结果的可视化观察反应结束后在扩增产物中加入100xSYBRGreenI染料后，在日光灯下可以迅速(1s左右)观察到阳性管溶液变为绿色，而阴性反应管呈现较淡的桔红色，如图2．19所示；在UV-800紫外光下可以观察到阳性反应管的溶液发出明亮的荧光，而阴性反应管没有荧光发出，如图2．20所示。图2．19RT-LAMP结果可视化观察(日光灯)Fig2-19VisualobservationoftheRT—LAMPresult(underdaylightlamp)左：阳性对照；右：阴性对照Left：Positivecontrol；Right：Negativecontrol67图2—20RT-LAMP结果可视化观察(紫外灯)Fi萨·20VisualobservationoftheRT-LAMPresult(underUVlamp)左：阳性对照；右：阴性对照Left：Positivecontrol；Right：Negativecontrol 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LAMP的爿臼屯与E基因抗康域的原核表达4．讨论乙型脑炎病(Japaneseencephalitisvirus，JEV)毒属于黄病毒科中的黄病毒属，其引起的日本乙型脑炎(Japaneseencephalitis)是一种以损害神经系统为主的急性传染病，会引起人类急性病毒性脑炎，目前已在占人类1／2人口居住的地区流行，其疫区已基本包括了亚洲大部分地区及澳大利亚，并有不断扩大的趋势，且在同一地区存在不同毒株同时流行的情况。JEV可以引起妊娠母猪出现流产或产死胎、公猪睾丸炎和仔猪的脑炎等等，给养猪业带来巨大的损失。更为重要的是猪可以作为JEV的储存和增殖宿主，在传播媒介蚊的作用下，可以使JEV在猪和人之间互相传播，JEV不仅给养猪业带来巨大损失，而且厄V在猪群中的流行也给人类的安全健康带来巨大的威胁。因此，建立一种快速、方便、准确的RT-LAMP方法来监测JEV在猪群中的流行情况，具有重要的经济价值和公共卫生学意义。4．1JEVRT-LAPM检测方法的评价LAMP是近年来发展起来的一种新型的检测技术，相比于其他的检测方法，LAMP更加的快速和方便，且其特异性和敏感性都比较好：(1)操作简单，无需PCR仪等昂贵设备，由于BstDNA聚合酶大片段在60一65℃范围内具有核酸双链解链和以瀑布式进行核酸扩增的功能，在恒温的条件下就可以进行核酸的变性与扩增，因此LAMP可以在恒温的水浴锅中进行反应，而不需PCR仪等昂贵设备；(2)特异性强，LAMP引物的设计决定了LAMP反应的特异性强，其针对靶基因的六个区域设计了四对引物，因此其特异性较高：(3)快速：由于不需要经历PCR反应中模板的退火、复性的过程，LAMP反应可以在1小时左右扩增出明显的梯状条带，而使用了环引物后其时间可以缩短至半小时内，可见其相较于PCR等具有更加快速的优势。(4)扩增产物鉴定方便快捷：由于LAMP的扩增效率极高，反应后溶液中存在大量的双链核酸，因此，LAMP反应结束后可以通过添加SYBRGreenI染料从颜色上来判断阴阳性，阳性反应管会变成绿色，而阴性反应管则为染料的颜色．桔红色，从而省去了电泳这一步；(5)灵敏度高，LAMP法检测的下限可以达到0．1pg甚至更低，同巢式PCR的灵敏度相当。 硕士论文广西猪JEVFc792分离株全基因序列的测定与分析反RT—LAMP的建立与E基因抗原域的尿棱表达此外，由于LAMP方法的扩增效率非常高，在只存在少量cDNA的情况下也能对核酸进行大量扩增，因此，LAMP法可以在逆转录酶存在的情况下，直接一步法扩增RNA，相较于普通PCR的先逆转录再进行PCR要方便很多，而且防止了由于多次操作带来的各种可能存在的污染。所以本研究旨在建立这种简单、快速、特异性强和灵敏度高的RT-LAMP法来进行JEV的快速诊断。4．2RT-LAMP的优化4．2．1M92+离子浓度优化镁离子浓度是LAMP反应中较为重要的一个影响因素，镁离子浓度影响着LAMP反应的特异性和敏感性，过高的镁离子浓度容易出现非特异性的扩增，而低浓度的镁离子浓度又会严重影响BstDNA聚合酶大片段的活性，且反应过程中产生的焦磷酸根离子又会与反应体系中的镁离子结合从而使镁离子的浓度进一步下降，以至使LAMP反应无法进行。本实验的结果也表明当镁离子的浓度低至lmmol／L时，无梯状条带产生。4．2．2dNTPs浓度的优化dNTPs是LAMP扩增的原料，依据LAMP的原理，随着扩增的进行，从dNTPs中会析出焦磷酸根离子，而焦磷酸根离子会跟体系中的镁离子结合形成白色的沉淀。因此，dNTPs的浓度与反应结束后白色沉淀的量息息相关。此外，焦磷酸跟与镁离子的结合会使体系中游离的镁离子减少，从而间接影响LAMP反应的效率。4．2．3反应温度的优化反应温度是对LAMP影响最大的因素之一，它与引物与模板之间正确有效结合息息相关。Bst聚合酶的的反应温度为60．65℃，低于60℃或者高于65℃使LAMP反应难以进行，本实验也证明在60．65℃的范围内都可以出现明显的梯状条带，且65℃时梯状条带最为明显，反应温度为55、58或者58℃时都无梯状条带出现。4．2．4Betaine浓度的优化Berne具有保持Bst聚合酶活性的作用，当反应体系中有Berne存在，能够保持Bst聚合酶的活性。本实验结果表明，在反应体系中不添加Berne依然 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达能够出现梯状条带，但为了保证LAMP反应的稳定性，建议添加甜菜碱，终浓度在0．5．1．0M之间。4．2．5引物浓度的优化普通的LAMP反应中用到两对引物F3／B3和FIP／BIP，前者称为外引物，后者称为内引物。根据LAMP的扩增原理，外引物主要在循环起始物的形成阶段发挥作用，其并不参与随后的循环扩增和延伸阶段，而内引物在参与整个LAMP反应过程。因此，LAMP体系中一般内引物的含量要远高于外引物，一般认为内外引物之比为1：4．1：10内较好。本实验也对内外引物的比进行了优化，试验结果表明，内外引物的浓度比为1：1(均为0．2mM)时，没有明显的梯状条带出现，当内外引物的浓度比2：1至16：1时均有梯状条带出现，但内外引物浓度为2：1和4：1时条状条带较淡，说明扩增产物较少j当内外引物浓度比为16：1时，条带最亮，说明其扩增产物最多，但其梯状条带不如内外引物浓度比为8：1时清晰典型。因此，本实验建立的RT-LAMP体系只内外引物浓度的最佳比例为8：1。4．3LAMP结果的可视化检测根据LAMP的反应原理，随着LAMP反应的进行，会有大量的焦磷酸盐离子产生，而产生的焦磷酸根离子会同LAMP反应体系中的镁离子结合从而产生焦磷酸镁的白色沉淀。PCR反应同样会产生焦磷酸镁白色沉淀，但其PCR的产物较少，因此形成的白色沉淀物较少，难以直接观察。LAMP反应结束的另一种可视化检测是在反应结束后添加SYBRGREENI，阳性管中出现比较明显的绿色，而阴性管中则依然为SYBRGREENI本身的橘红色。本实验发现，LAMP反应结束后未观察到溶液明显的浑浊，故可视化检测采用反应结束后添加SYBRGREENI染料的方法，结果可靠。4．4LAMP的污染问题及解决办法LAMP反应的高敏感性促使LAMP反应很容易出现假阳性，这也是制约LAMP推广的原因。可以采用以下方法尽量避免污染问题的出现：(1)试剂的分装与存放：LAMP相关试剂在购买回来后应尽快在无菌操作70 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析反RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达台中进行分装，分装后的试剂应单独存放，尽量避免同其他试剂一起存放；(2)分区操作：LAMP试剂的存放、核酸的提取、LAMP反应体系的配制、DNA或RNA模板的加入以及LAMP的扩增最好能分区操作，每进行一步操作需要更换手套，避免假阳性的出现；(3)严格操作：实验过程中应穿试验服、戴手套，实验过程中应及时更换。要始终坚持在冰盒上进行操作，配备专用的移液器和枪头，实验结束后及时处理用过的器材，并用紫外灯进行照射；(4)实验过程中如发现某种或某些试剂发生污染应及时更换，尽快解决污染问题。LAMP缺点：LAMP反应的扩增产物不能进行测序、克隆以及表达，它只能用于病原微生物的快速检测方面。5小结5．1本研究建立了JEVRT-LAMP检测方法，通过优化影响RT-LAMP反应的主要因素，确定了JEVRT-LAMP的反应体系和反应条件。5．2运用建立的RT-LAMP对PCV2、PRV、JEV、CSFV、PRRSV、PEDV进行特异性实验，结果只有JEV为阳性而出现特殊的梯状条带，其他病毒为阴性，说明建立的RT-LAMP方法具有较高的特异性。5．3本实验建立的JEVRT-LAMP方法能检出0．5pg的RNA，与本实验室建立的JEVRT-Nested．PCR的灵敏度相当，两者检出率的符合率为90．9％。5．4从处理样品到得出诊断报告，RT-LAMP方法耗时约3h，而RT-Nested．PCR方法耗时约7h，普通常规PCR耗时约5h，RT-LAMP的检测时间至少缩短了2h。5．5LAMP方法不需要比较昂贵的实验仪器如PCR仪等，只使用简单的水浴锅等仪器就可以完成，操作非常简单，反应耗时短。并且反应结束后，可以在反应产物中添加SYBRGreenI，通过肉眼观察溶液颜色的改变来判断结果，从而达到快速、简便鉴定结果。71 硕士。论文J．’西猪JEVFC792分离期L全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达研究三广西猪JEVFC792分离株E基因主要抗原域I、II的克隆、原核表达与免疫原性的初步研究1．材料、试剂与仪器1．1菌种、毒株及载体毒株：JEV广西分离株FC792第三代细胞毒；乙型脑炎病毒疫苗株SAl4．14．2，购自成都中牧实业股份有限公司；菌种：E．coliDH5a和BL21(DE3)、Rosetta(DE3)为本实验室保存；载体：pMD-18T(Takara产品)、pET-32a(+)为本实验室保存。1．2主要试剂限制性内切酶：HindlII、BamHI、T4DNA连接酶，大连宝生物产品DNA凝胶回收试剂盒：购白天根生物小量质粒抽提试剂盒：购自上海生工SDS：Sigma公司产品TaqDNA聚合酶：天根生物RNATrizol、胰蛋白胨、酵母粉、琼脂糖：上海生工DNAMarker：天根生物低分子量标准非预染蛋白Marker：Promega；低分子量标准预染蛋白Marker：南京凯基生物IPTG-为Promega产品精氨酸、DTT：博迪化工"Iris：上海生工TEMED聚合剂：上海生工丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺：Solarbio 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的强口匠与E基因封叫鄹啜的原棱表达HRB．DAB显色试剂盒(天根生物)抗His标签单克隆抗体(天根生物)HRP标记的羊抗小鼠、HRP标记的兔抗猪IgG二抗(Sigma公司)Ni-NTA树脂填料：QiagenPEG20000：Solarbio公司弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂：omiga公司产品DMEM高糖培养液：Hyclone公司产品胎牛血清：Gibico公司产品JEVELISA试剂盒：武汉科前1．3引物的设计、合成和序列的测定使用Primer5．0和oligo6．0进行引物设计，引物合成和克隆基因序列的测定均由上海生工完成。1．4主要仪器蛋白垂直电泳槽(天能)、48孔双槽PCR反应仪(伯乐)、凝胶成像系统(天能)、超声波破碎仪、DNA水平电泳槽(北京六一)、万向摇床、半干转膜仪、核酸蛋白分析仪、紫外分光光度计、冷冻高速离心机、恒温摇床、电子pH计、制冰机等。1．5主要试剂和培养基的配制1．5．1常用培养基的配制LB培养基：方法同研究二1．5．1。LA培养基：方法同研究二1．5．1。1．5．2DNA水平电泳缓冲液的配制方法同研究二1．5．2。 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达1．5．3制备感受态细胞所使用的试剂的配制方法同研究二1．5．3。1．5．4SDS-PAGE使用试剂的配制1)1．5mol／LTris．HCl(PH8．8)的配制：准确称取Tris90．89，加双蒸水至500mL，用浓HCI调pH至8．8，4"C冰箱保存备用。2)Imol／LTris—HCI(pH6．8)：称取Tris24．239，加双蒸水至200mL，用浓HCl调pH至6．8，4"C冰箱保存备用3)30％Acr-Bis：称取Acr(丙烯酰胺)1459，Bis(N，N双甲基丙烯酰胺)59，加蒸馏水至500mL，搅拌混匀，过滤除去不溶物，棕色瓶4"C避光保存。4)20倍SDS电泳缓冲液的配制：准确称取甘氨酸2889，Yris60．49，SDS409，加去离子水配成1L的电泳液，使用时进行20倍稀释即为工作液。5)2×SDS·PAGE上样缓冲液的配SU．1mol／LTris-HCI(pH6．8)10mL，SDS49，溴酚蓝O．29，甘油20mL，加双蒸水至100mL，室温储存，使用前加DTT使其终浓度为200mM。6)IO％APS(过硫酸铵)：称取APS0．19放入EP管中，加蒸馏水至lmL，分装成小管，每管100“L，．20℃保存备用。7)染色液的配制：称取考马斯亮蓝R2502．59，量取甲醇500mL，醋酸50mL，加450mL蒸馏水使其总体积为1000mL，室温保存。8)脱色液的配制：依次量取甲醇50mL，醋酸70mL，蒸馏水880mL，即为1000mL脱色液，室温保存备用。1．5．5Westernblot主要试剂的的配制1)转移缓冲液的配制：称取甘氨酸2．939，SDS0．3759，Tris5．829，量取甲醇200mL，加双蒸水定容至1L。2)10倍PBS配制：准确称取NaCl187．79，Tris12．19，用双蒸水定容至1L。3)PBS．T的配制：将10倍的PBS稀释10倍，加入0．5％的吐温20。4)封闭液的配制：量取50mL的PBS．T，DH,k0．259的脱脂奶粉，完全溶解即可。74 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原校表达1．5．6蛋白纯化缓冲液的配制1)裂菌缓冲液的配制：准确称取NaH2P047．89，NaCl17．539，蒸馏水定容至1L，用10MNaOH调pH值至8．0，，4"C冰箱保存备用。2)包涵体洗涤液的配制：准确称取Tris6．0579，NaCl5．8449，EDTANa20．7449，量取TritonX一1005mL，加水定容至1L，用10MNaOH调pH值至8．0，4"C冰箱保存备用。3)BufferB：准确称取NaH2P043．129，Tris0．2429，尿素96．19，加蒸馏水定量至200mL，用10MNaOH准确调pH值至8．0，4℃冰箱保存备用；4)BufferC：配制方法同BufferB，用浓HCl调pH值至6．3，4℃冰箱保存备用；5)BufferD：配制方法同BufferB，用浓HCl调pH值至5．9，4"C冰箱保存备用；6)BufferE：配制方法同BufferB，用浓HCl调pH值至4．5，4"C冰箱保存备用；1．5．7Ni-NTA树脂再生试剂的配制1)剥离缓冲液：准确称取盐酸胍57．329，量取醋酸1．14mL，加去离子水定容至100mL；2)洗涤液：称取SDS29，加去离子水至100mL；3)蛋白洗脱液：准确称取EDTANa27．449，加去离子水至200mL：4)Ni离子补充剂：准确称取NiS04．6H202．639，加去离子水定容至100mL；5)25％、50％、75％及无水乙醇的准备。1．5．8蛋白复性液的配制1)复性液一的配制：准确称取Tris6．0579，EDTANa21．861g，NaCl2．9229，精氨酸109,还原型谷胱甘肽O．1549，氧化型谷胱甘肽0．061g，尿素360．369，量取甘油50mL，加去离子水定容至1L；2)复性液二的配制：准确称取"Iris6．0579，EDTANa21．8619，NaCl2．9229，精氨酸109，还原型谷胱甘肽0．1549，氧化型谷胱甘肽0．0619，尿素240．249，75 硕士论文广西猪JEVFC792分离糠全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达量取甘油50mL，加去离子水定容至1L；3)复性液三的配制：准确称取Tris6．0579，EDTANa21．8619，NaCl2．9229，精氨酸109，还原型谷胱甘肽0．1549，氧化型谷胱甘肽0．0619，尿素120．129，量取甘油50mL，加去离子水定容至1L；4)复性液四的配制：准确称取Tris6．0579，EDTANa21．8619，NaCl2．9229，精氨酸109，还原型谷胱甘肽0。1549，氧化型谷胱甘肽0．0619，量取甘油50mL，加去离子水定容至1L。76 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达2实验方法与步骤2．1引物引物Ea．F、Ea．R为参考杨耀武设计的引物、Eb．F、Eb．R为参考郑其升设计的引物，E-F、E-R为自己使用软件Primer5．0和oligo6．0所设计。详见表2—10。表2一10引物序列和位置Table2-10Thesequenceandpositionoftheprimers2．2样品的准备FC792株第三代细胞毒，反复冻融3次，4"C、8000rpm离心5min，取上清用于RNA提取。2．3RNA的提取及反转录方法同研究二2．32．4目的基因的扩增2．4．1JEVE基因的扩增251．tL反应体系：cDNA51xL，10xtaqBuffer2．5此，dNTPs0．51xL，上游引物E—FO．51xL，下游引物E—R0．5lxL，taq酶0．251xL，加灭菌去离子水至25}tL。 硕士论文广西猪JEVFC792分离糠全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达2．4．2JEV抗原域III基因E。的扩增251aL反应体系：cDNA5肛L，10xtaqBuffer2．5p,L，dNTPs0．5}tL，上游引物E。一FO．5肛L，下游引物E。一R0．5}tL，taq酶0．25p,L，加灭菌去离子水至25I．tL。2．4．3JEV抗原域III基因Eb的扩增25I_tL反应体系：cDNA51aL，10×taqBuffer2．5斗L，DNTP0．5-tL，上游引物Eb-FO．5liL，下游引物Eb—R0．51aL，taq酶0．25“L，加灭菌去离子水至25}tL。JEVE、E。、Eb基因PCR扩增程序：详见表2．11。表2—11JEVE、E。、Eb基因PCR扩增程序Table2—11PCRamplificationprogramsofJEVE、Ea、Eb2．4．4PCR产物电泳与DNA凝胶回收方法同研究二2．4．2。2．5目的基因克隆2．5．1DH5。、BL21、Rosetta(DE3)感受态细胞的制备方法同研究二2．5．1。2．5．2目的基因与PMD一18T克隆载体的连接方法同研究二2．5．2。78 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LA肝的建立与E基因抗原域的屎校表达2．5．3转化方法同研究二2．5．3。2．5．4质粒抽提与酶切鉴定方法同研究二2．5．4。2．6重组表达质粒的构建2．6．1双酶切与胶回收取测序正确的pMD．18T-Ea和表达载体pET-32a(+)，用BamHI和HindⅢ(引物两端含有BamHI和HindIII的酶切位点)进行双酶切；酶切体系为50此，其中限制性内切酶BamHI和HindIII各1．01xL，对应内切酶Buffer各5．0I．tL，pMD．18T-E。(或表达载体质粒pET-32a(+))201xL，其余用灭菌的双蒸水补足；37。C酶切过夜，将全部501上L酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段并进行纯化，胶回收和纯化步骤按DNA凝胶回收与纯化试剂盒的说明进行操作。2．6．2目的基因与pET-32a(+)的连接将回收纯化的目的基因E。和pET-32a(+)表达载体片段DNA进行浓度测定后，设计酶切体系。实验采用201xL的连接体系，目的基因DNA8p,L，pET-32a(+)载体DNA2此，T4连接酶2止，T4连接酶Buffer21xL，加灭菌双蒸水至201xL：16。C连接过夜。2．6．3连接产物转化至克隆菌株DH5。转化方法同2．5．3。2．6．4质粒提取与酶切鉴定质粒提取与酶切鉴定方法同2．5．4中的方法；酶切鉴定正确后送往生物公司进行序列测定。79 硕士论文广西猪JEvFC792分离株全基因序列的测定与分析反RT—LA船的建立与E基因抗原域的原核表达2．6．5重组表达质粒转化表达菌种将测序正确的重组表达质粒pET-32a-E。转化进表达菌株Rosetta(DE3)和BL一21(DE3)中，转化方法同2．5．3中的转化方法。2．6．6质粒提取与酶切鉴定质粒提取与酶切鉴定的方法同2．5．4中的方法。2．7重组蛋白E。的诱导表达及鉴定2．7．1重组蛋白诱导表达、诱导条件的优化将2．6．6中酶切鉴定已正确导入原核表达质粒pET-Ea的阳性菌株(pET-Ea-BL21和pET-Ea-Rosetta)以1：100接种到含100}tg／mL氨苄西林钠的LB培养基中，放于摇床中，37"C、200rpm过夜培养；再以1：100的比例接种到含10099／mL氨苄西林钠的100mLLB培养基中(Rosetta菌株则需再加入氯霉素至终浓度2599／mL)，扩大培养至OD600啪值为0．6左右时(约3h)，等分成若干管，每管4mL，用于做IPTG浓度，诱导温度和诱导时间等优化。取各诱导条件下的菌液lmL，8000rpm离心2min，用100pL的PBS悬浮，加等量的2倍上样缓冲液，煮沸5min，4"C保存待用。2．7．2SDS—PAGE电泳检测2．7．2．1SDS．PAGE用浓缩胶和分离胶的制备1)取Talon制胶的厚玻璃板和薄玻璃板用固定夹板夹住，放于制胶架上，两块玻璃板之间有lmm的间隙用于灌胶；2)取10mL洁净的西林瓶，向西林瓶内加入30％Acr-Bis200011L，1．5M的Tris—Hcl1250pL，双蒸水165011L，10％SDS501．tL，10％APS5011L，最后加入3此的聚合剂TEMED，混匀后加入到制胶板中，至胶层高度距玻璃板顶端一个梳子的长度加lmill处为止，再加入lmL的无水乙醇；3)待分离胶凝固后(大约20—30分钟)，吸尽无水乙醇；4)取洁净的10mL西林瓶，依次加入去离子水10509L，30％Acr-Bis500pL，1MTris-Hcl380lxL，10％SDS和10％APS各159L，最后加入2p,L的聚合 硕士论文广西猪JEVFC792分离栋全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达剂TEMED，混匀后加入制胶板中至于玻璃板上缘平齐，小心插入梳子，避免气泡产生。2．7．2．2上样与SDS．PAGE电泳1)待积层胶凝固后，拔除梳子将处理好的样品加入到孔内，进行电泳。2)电泳：将电压调至80V进行电泳，待样品进入分离胶后(大约15分钟)，将电压调至IOOV，电泳2小时左右。3)电泳完后，将分离胶放入考马斯亮蓝中染色1h以上，再用脱色也进行脱色2．3次，直至条带清晰为止。2．7．3Western．Blot鉴定重组蛋白E。的表达进SDS．PAGE电泳，出现与预测目的蛋白大小相近的条带后还需用Western-blot进一步鉴定表达情况。2．7．3．1蛋白转移1)取出电泳结束后的凝胶，剪取于凝胶大小相当的NC膜一张，厚滤纸两张，应使NC膜稍大于厚滤纸，厚滤纸稍大于凝胶；2)将凝胶、厚滤纸和NC膜放于转膜缓冲液中平衡20分钟；3)用半干氏电转仪进行蛋白转印，从负极到正极(从下到上)依次放好厚滤纸、凝胶、NC膜、厚滤纸，注意应避免上下两层滤纸直接接触，每次放置时均应用玻棒小心取出气泡。4)以30mA恒定电流，转印2h。2．7．3．2Western-Blot1)转印完成后，通过观察NC膜上预染Maker条带来判断转印效果的好坏，将成功转印的NC膜用PBST漂洗2．3遍后，放入封闭液中封闭，37℃封闭2小时或46C封闭过夜；2)取出封闭完成的NC膜，用PBST漂洗3次，每次5分钟，将膜放入护卡膜(塑胶袋)中，用封膜机封住三边，从最后一边的开口处加入稀释好的 硕士论文广’西猪JEVFC792分离期‘全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的舭与E基因抗原域的原核表达一抗(一抗分别为鼠源抗His抗克隆抗体)，保证一抗能够完全盖过膜上的所有区域，排尽气泡后，将塑胶袋的最后一边也用封膜机封口，37℃孵育1小时或者室温2小时；3)一抗孵育完成后，取出NC膜，用PBST清洗3次，每次5分钟，用同样的方法孵育二抗(羊抗鼠单克隆抗体)，室温1．2小时。4)二抗孵育完成，取出NC膜，用PBST漂洗5次，每次3分钟，将NC膜同样放在护卡膜中进行显示，显示方法按照试剂盒上的说明进行，在lmL缓冲液中加入甲液和乙液各50旺，混匀后加入到护卡膜中进行显示，待出现较明显的条带时(约5．15分钟)终止显色，进行拍照。2．7．4重组蛋白抗原性的初步鉴定蛋白转移及Western．Blot方法基本同2．7．3．1和2．7．3．2，将孵育的一抗换为1：40稀释的JEV阳性猪血清，二抗则用辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG隆抗体。2．7．5重组蛋白表达形式的鉴定经Western．Blot鉴定重组蛋白pET-Ea得到表达，且初步鉴定重组蛋白pET-Ea具有抗原性后，即进行重组菌的大量诱导表达，鉴定重组蛋白的表达形式。1)先将出租菌1：100接入数份4mL的LB培养基中，放入恒温摇床，37℃、200rpm过夜培养，第二天去过夜培养的重组菌以1：50接入大量的新鲜的LB中，37。C、200rpm至OD600nm大约为0．6时，根据之前优化的结果，加入适量的IPTG进行诱导表达，诱导4小时；2)将诱导后的菌液转入离心瓶中，40C、4000rpm离心15分钟收集菌体，将菌体用裂菌缓冲液进行悬浮(每克湿菌约加入裂菌缓冲液10mL)，反复冻融3．5次后在冰浴下进行超声波(400W、超8s停8s，超声60．80次，每超声20次，轻轻将菌液摇匀一次)破碎菌体。3)将裂解产物，转移至离心管中，40C、12000rpm，离心15分钟。取上清少许加入等量的2倍上样缓冲液；挑取少量沉淀用PBS悬浮后加等量2倍上样缓冲液，煮沸5分钟。将处理好的上清和沉淀样品进行SDS．PAGE电泳分析，判断重组蛋白pEToE。的表达形式，SDS．PAGE的方法见。 硕士论文广西猪JEvFC792分离糠全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达2．8重组蛋白pETE。的纯化及复性2．8．1重组蛋白的纯化2．7．6中已鉴定重组蛋白pET-Ea以包涵体的形式进行表达。重组蛋白pET-E。上融合了载体pET-32a上的多聚组氨酸(6xHis)标签，故选用Ni2+螯合亲和层析法来进行重组蛋白pETEa的纯化。2．8．1．1包涵体的纯化1)将裂解产物高速离心后得到的沉淀即为包涵体，先用包涵体洗涤液洗涤包涵体沉淀数遍后，加入适量的BufferB室温溶解1．2小时，也可室温溶解1．2小时后放置于4"C溶解过夜。40C、12000rpm离心15分钟，取上清进行纯化；2)将Ni-NTA轻轻混匀后，填装2-3mL至层析柱中，静置5．10分钟，使树脂沉降至层析柱的底部，此时打开帽子让30％的乙醇流出(树脂填料中本身含有等体积30％的乙醇)，用适量的BufferB平衡10分钟；3)打开帽子，将BufferB流出，即可加入根据蛋白浓度添加待纯化的蛋白液(约为8倍柱体积)，调整帽子控制好流速(约5．8秒一滴)，必要是可将收集的穿透液再次过柱；4)依次用8倍体积的BufferC冲洗柱子2次、1倍体积的BufferD4次，1倍体积的BufferE4次，分别收集每次的流出液，取适量加入等体积的上样缓冲液进行SDS—PAGE电泳分析，确定目的蛋白洗脱缓冲液和冲洗次数。2．8．1．2Ni-NTA树脂的再生填好的Ni-NTA树脂在使用2．3次后，应进行清洗的再生，以保证纯化的效果和延长树脂的使用寿命。1)用2倍树脂体积的剥离Buffer冲层析柱中的树脂填料，可以轻微的用玻棒将树脂轻轻搅匀；2)用去离子水冲洗树脂填料两次，每次3个柱体积；3)接着再用2倍柱体积的2％的SDS清洗树脂，轻轻将树脂旋起，以83 硕士谴?文J．’西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LA碉’的建立与E基因抗原域的原核表达达到更好的清洗效果；4)再依次用l倍树脂体积的25％、50％和75％的冲洗树脂；5)再用无水乙醇冲洗树脂两次，每次3个柱体积。6)再分别用1倍树脂体积的75％、50％和25％的乙醇冲洗树脂；7)用2倍树脂体积的去离子水冲洗，以洗去乙醇；8)用5倍柱体积的100mM的EDTA，冲洗树脂，以螯合去除，此时可见树脂变为白色；9)用2—3倍柱体积的去离子水清洗树脂，将EDTA清洗干净；10)在添加3倍柱体积的100mM的NiS04，以补充Ni2+，静置15分钟后用水冲洗，2倍柱体积冲洗3次。此时可见树脂又变成干净的浅蓝色，再生完成，使用前用BufferB平衡即可。2．8．3包涵体的复性本实验中重组蛋白是以包涵体的形式得到表达，在纯化的过程中使用的高浓度的尿素变性溶解包涵体，故需要将纯化的蛋白进行复性，本实验采用透析袋梯度透析的方法，是重组蛋白缓慢复性重折叠。1)透析袋使用前的处理：戴手套将透析袋剪成15．20mm长的小段，将其放入1L煮沸的2％(mⅣ)NaHC03与lmM的EDTA溶液中，煮沸10分钟；取出透析袋，用大量的去离子水冲洗干净后，再放入1L煮沸的lmM的EDTA中煮沸10分钟，用去离子水冲洗干净后放入30％乙醇溶液中，4"C保存备用，使用前去除，用去离子水冲洗干净；2)在透析袋的一段夹好透析夹，将透析袋内装满去离子水后倾去，如此重复两次以彻底清洗干净透析袋；将待复性的蛋白液，加入到透析袋中，夹好透析夹，放入1L的复性液一中，4"C透析8小时，用磁力搅拌器不断搅拌，保证透析完全；3)由复性液一换成复性液二，同样条件透析8小时；4)由复性液二换成复性液三，同样条件透析8小时；5)由复性液三换成复性液四，同样透析条件透析两次，每次12小时。 硕士论文广西猪JEVFC792分离株金基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的尿棱表达2．8．4Western—Blot鉴定复性后重组蛋白E。的抗原性将复性后的重组蛋白进行SDS—PAGE电泳及Western-Blot初步鉴定重组蛋白的抗原性。用接种JEV疫苗株SAl4．14．2的小鼠血清作为一抗，用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体作为二抗，进行Western-blot分析。SDS．PAGE方法同2．7．2；Western-Blot鉴定方法同2．7．3。小鼠免疫疫苗株SAl4．14．2获得JEV阳性血清的免疫方案：1)用PBS将疫苗株SAl4．14．2细胞毒进行倍比稀释；2)皮下多点注射4周龄SPF级昆明小鼠，间隔一周后同样方法进行二免；3)断尾采血获得小鼠血清用ELISA法检测抗体水平，如有需要则进行三免、四免；4)当血清中JEV抗体水平较高时，摘除眼球采血，获得JEV阳性小鼠血清。2．9蛋白免疫原性的初步研究2．9．1制备免疫用蛋白抗原将复性完成的透析袋从复性液四中去除，用PEG．20000(聚乙二醇，分子量为20000)进行包埋，将蛋白适当浓缩后(一般最好浓缩后的蛋白含量在2mg／mL)，测定蛋白浓度。将浓缩后的蛋白与弗氏完全佐剂等量混合，摇匀至不分层时即为一免用的蛋白抗原；二免时取浓缩蛋白与等量弗氏不完全佐剂等量混合后摇匀作为二免用蛋白抗原。2．9．2小鼠免疫方法SPF级昆明小白鼠(109／只)50只，分成5组，4个实验组，1个对照组，10只／组。1)首免将蛋白液与等体积弗氏完全佐剂反复混匀，静置30分钟不分层时，即可用于小鼠免疫；第一至四组分别免疫重组蛋白500p,g、200p,g、501xg85 硕士论文广西猪JEVF(：792分离株全基因序列的澳I定与分析及RT—LAMP的翼臼屯与E基因抗扇H或的原核表达和lOI_tg每只，第五组免疫同第一组等量的弗氏完全佐剂与PBS的混合液；2)一周后进行二免，二免时用弗氏不完全佐剂和等量的蛋白液混匀，免疫用抗原的剂量同首免(表2．12)；3)二免一周后断尾采血，分离血清，用包被全病毒的ELSIA试剂盒检测抗体是否产生。表2—12小鼠免疫方案Table2·12Theprogrammesofmiceimmune注：浓缩后蛋白的浓度为2．26mg／mL，500肛g蛋白即为221斗L的蛋白液，故佐剂量亦为221pL。对照组采用与第一组同样的剂量注射PBS和佐剂的混合液。2．9．3JEV中和试验免疫组和对照组小鼠眼球采血，分离血清，用包被有JEV全病毒的ELISA试剂盒，检测免疫Ea后的小鼠血清内是否有相应抗体存在。用ELISA试剂盒检测为阳性的血清两份、检测为阴性的血清一份，用来做病毒的中和实验，判断抗E。的抗体是否具有中和病毒的能力。2．9．3．1TCID50的测定1)吸取0．1mL病毒液(JEVFC792分离株)加入0．9mL的PBS，用移液器吹打混匀。 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原校表达2)再吸取O．1mL的混合液移于第2个装有0．9mL的PBS的EP管中，充分混匀后再移取O．1mL加入第3个EP管。3)依次类推，获得10～．10罐一系列的病毒稀释液。4)吸取每一稀释度的病毒液O．1mL，接种至已基本长成单层BHK．21细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度的做8个重复。5)放入37"C，5％C02培养箱中静置培养，逐日观察至接毒后第7天，做好记录，同时在96孔板的最后两列作为阴性对照。6)用Reed．Muench法确定疫苗株SAl4—14．2和本实验室分离株FC792细胞毒的TCIDso。2．9．3．2ELSIA检测小鼠血清中的抗Ea抗体水平的检测，根据ELISA试剂盒的说明进行，仅将试剂盒中的羊抗猪酶标二抗更换为羊抗小鼠酶标二抗，其他条件均依照试剂盒的说明书进行。2．9．3．3病毒中和实验病毒中和实验采用固定病毒液、倍比稀释血清的方法。1)将己测定好TCID50的病毒液，稀释至200个TCIDso；2)将免疫组经ELISA检测确定为阳性的小鼠血清56℃灭活30分钟；3)将灭活后的阳性血清用0．22¨m的滤器过滤除菌；4)将小鼠阳性血清进行2倍稀释，得到1：2、1：4、1：8、l：16、l：32、l：64、l：128和1：256各稀释度的血清；5)取251．tL各稀释度的血清与等量的200个TCID50的病毒液混匀后，在37。C温箱中作用1小时，再将混合液加入到96孔板中，并加入刚刚消化，吹散的BHK．21细胞悬液501．tL。逐日观察细胞病变情况至第七天，记录实验结果。同时应做不加小鼠血清的孔作为JEV病毒毒力试验对照、血清对细胞的毒性对照和正常空白BHK．21对照；6)记录细胞病变情况，计算中和抗体效价。 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LA^lP的建立与E基因抗原域的原核表达3．结果与分析3．1pET-E。原核表达载体的构建3．1．1E。基因的扩增和酶切鉴定以JEVFC792株的cDNA为模板，以Ea-F和Ea-R为引物进行PCR扩增，取201xLPCR扩增产物用1．2％的琼脂糖凝胶进行水平电泳，电泳得到的目的片段与预期的1113bp相符(图2—21)。用BamHI和HindIII进行双酶切鉴定，切出两条片段，分别与PMD．18T载体和预期目的基因大小一致(图2-22)．将酶切正确的质粒送往生物公司进行测序，将测序所得序列与NCBI上已发表的JEV基因序列进行比对，确定为目的基因。M图2—21E。片段的PCR扩增Fig2—21ApmlicationofE。byPCR1：PCR扩增产物；M-MarkerDL-2000plus2：PCRproducts；M：MarkerDL-2000plus2000bp————卜1000bp———◆M图2．22重组质粒T—E。的酶切鉴定Fi92—22IdenficationofofrecombinantplasmidT-E8M-MarkerDL2000；l：0E。的酶切鉴定M：MarkerDL2000；l：T-EadigestedbyBamHIandHind】p旧p纠旧旧叭吣∞叭O5a，72 硕士论文广西猪JEvFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E蕊因抗原域的原棱表达3．1．2重组表达质粒pET-E。的鉴定将重组质粒T-E。和pET-32a(+)分别用BamHI和HindIII进行双酶切，酶切后进行电泳，切胶回收目的基因E。和pET-32a+载体片段，用T4连接酶16度连接过夜以构建重组表达质粒pET-E。。重组质粒转化DH5a，筛选阳性菌落，抽提质粒用BamHI和HindIII进行双酶切鉴定，酶切产物进行电泳，得到大小约为5900bp的pET-32a载体片段和大小约为1110bp的目的DNA片段，与预期大小相一致(图2—23)。将酶切正确的重组质粒送往生物公司测序，证实成功构建表达质粒pET-E。。Ea1000bp图2-23重组质粒pET-E。的酶切鉴定Fig2—23IdenficationofrecombinantplasmidpET-EaM：MarkerDL2000；1：pET-Ea的酶切鉴定M-MarkerDL2000；1：pET_EadigestedbyBamHIandHindIII3．2重组蛋白的表达与鉴定3．2．1pET-E。转化BL-21(DE3)并诱导表达E。编码371个氨基酸残基，序列插入到pET-32a载体上后，预计融合蛋白的分子量约为58kDa。将重组质粒转入BL．21(DE3)并诱导表达，结果发现重组蛋白为未能在BL．21中得到表达。 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达3．2．2pETE。转化大肠杆菌Rosetta(DE3)及重组蛋白的诱导表达3．2．2．1IPTG浓度的优化分别以终浓度0．2mM，0．4mM，0．8mM，1．0mM和2．0mM的IPTG诱导浓度，37。C诱导4小时，结果发现各IPTG浓度诱导下重组蛋白的表达量几乎相当(图2-24)。65kDa——◆图2．24IPTG浓度的优化Fig2-24OptimizetheconcentrationofIPTGEaM：蛋白质分子量Marker；l：未诱导；2-6：IPTG浓度依次为0．2、0．4、0．8、1．0和2．0mM；7：1．0mMIPTG诱导pET-32a空载体转化菌M：proteinMarker；1：pET-Ea-Rosetta(DE3)withoutinduction；2-6：pET-Ea-Rosetta(DE3)inductedby0．2、0．4、0．8、1．0and2．0mMIPTG；7：pET-32a-Rosetta(DE3、inducedby1．0mM 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达3．2．2．2诱导时间与诱导温度的优化以IPTG终浓度为0．2mM，与25。C、30℃和37℃诱导表达5小时，结果发现，在25℃的诱导温度下未发现目的蛋白条带，30℃时目的蛋白得到表达，但表达量很低，37。C的诱导温度下有相对较高的表达量(图2-25)。卜Ea图2．25诱导温度的优化Fig2-25OptimizetheinductiontemperatureM：蛋白分子量Marker；1：25℃诱导；2：30℃诱导；3：37℃诱导M：proteinMarker；l：inducedat25。C；2：inducedat30"C；3：inducedat37℃．91 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达以IPTG终浓度为0．2mM，37。C分别诱导1、2、3、4、5小时，观察目的蛋白表达量的变化情况，实验发现诱导3小时之后目的蛋白的表达几乎不再增加(图2-26)。M123456图2．26诱导时间的优化Fi醇-26Optimizetheinductiontime●一一E。M：蛋白分子量Marker；1．5：37。C诱导1、2、3、4、5小时；6：空载体转化菌37。C诱导4小时M：proteinMarker；1-5：induced1,2，3，4，5hour(hours)at37"C；6：PET-32a-Rosetta(DE3)induced4hours 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原校表达3．2．2．3重组蛋白表达形式的鉴定重组菌经反复冻融，超声破破碎后，离心取上清和沉淀做SDS．PAGE分析，发现目的蛋白主要表达在包涵体中(图2-27)。120kDa一◆68kDa——◆47kD}—◆M12图2．27表达形式的鉴定●一EaFig2-27IndentifytheexpressionformofEaM：蛋白分子量Marker；1：重组菌裂解后上清；2：重组菌裂解后沉淀M：proteinMarker；l：thesupematantafterdisruptedtheinducedPET-Ea-Rosetta(DE3)；2：thesedimentafterdisruptedtheinducedPET-Ea-Rosetta(DE3)；93 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的奠。电与E基因抗原域的原核表达3．2．3E。重组蛋白表达的鉴定及抗原性的初步鉴定3．2．3．1E。重组蛋白表达的鉴定为验证在58kDa位置的蛋白是否为Ea重组蛋白，应重组蛋白融合有多聚组氨酸标签，故采用抗His-tag的单克隆抗体作为一抗，二抗用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体进行Western-blot分析。结果表明诱导重组菌在58kDa处出现特异性的棕色条带，空载体转化菌经诱导后则在约20kDa处出现棕色条带，未诱导重组菌则未在58kDa处出现条带(图2-28)。图2．28重组蛋白表达的Western．blot检测Fig2-28Western—blotanalysisoftherecombinantproteinEaM：预染蛋白分子量Marker；1：诱导后重组菌：2：未诱导重组菌；3：诱导pET-32a空载体菌M：prestainedproteinMarker；1：theinducedpET-Ea-Rosetta(DE3)；2：theuninducedpET-Ea-Rosetta(DE3)； 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因割U陇的原核表达3．2．3．2E。重组蛋白抗原性的初步鉴定为了初步验证Ea重组蛋白是否具有抗原性，用JEV阳性猪的血清作为一抗j辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体作为二抗，进行Western．blot分析。结果表明，重组蛋白E。能够跟JEV阳性猪血清结合，具有较好的抗原性(图2-29)。Ml2图2．29重组蛋白抗原性分析Fig2-29Western-blotanalysistheantigenicityOfrecombinantEaproteinM：预染蛋白分子量Marker；1：诱导后重组菌：2：未诱导重组菌；M：prestainedproteinMarker；l：theinducedpET-Ea-Rosetta(DE3)；2：theuninducedpET-Ea-Rosetta(DE3)； 硕t啼鲁文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达3．3E。重组蛋白的纯化与复性3．3．1E。重组蛋白Ni-NTA亲和层析纯化将大量诱导的重组菌反复冻融，超声波破碎离心后的沉淀经洗涤后即为包涵体，加入适量的BufferB溶解包涵体，离心取上清经Ni-NTA进行变性蛋白的纯化，将穿透液重复过柱后用BufferC(pH6．3)洗涤柱子数次，再依次用BufferD(pH5．9)和BufferE(pH4．5)洗涤数次，收集洗脱液用于SDS-PAGE分析，结果表明重组蛋白E。主要被BufferE洗脱(图2-30)。图2．30重组蛋白Ea纯化的SDS．PAGE分析Fig2—30SDS—PAGEanalysistherecombinantEaproteinafterpurificationM：蛋白分子量Marker；1：穿透液；2：BufferC洗脱液；3-BufferD洗脱液；4．8-BufferE洗脱液E1、E2、E3、E4、E5M-proteinMarker；l：FT；2：BufferC(washbuffer)；3：BufferD；4—10：eluteBufferE(E1toE5)withthepurifiedEEaprotein 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原极表达3．3．2重组蛋白E。的复性及复性后抗原性分析采用透析袋梯度透析法将纯化得到的变性重组蛋白E。重折叠复性，复性后用接种JEV疫苗株SAl4．14．2的小鼠阳性血清作为一抗，用辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体作为二抗，进行Westem．blot分析。结果表明，重组蛋白能够跟JEV阳性小鼠血清结合，在58kDa处出现特异性棕色条带，而用JEV阴性小鼠作为一抗进行Western．blot分析则在58kDa处未出现条带(图2—31)，说明复性后的重组蛋白E。具有良好的抗原性。118kDa65kDa47ma图2-31复性Ea蛋白抗原性分析Fig2—31Western-blotanalysistheantigenicityOfEaproteinafterrenatureM：预染蛋白分子量Marker；l：用JEV阳性小鼠血清作为一抗进行western．blot分析；2：用JEV阴性小鼠血清作为一抗进行western．blot分析；M：prestainedproteinMarker；1：western-blotanalysistheantigenicityOfEaproteinusetheJEVpositivewhitemouseserum；2：western—blotanalysistheantigenicityOfEaproteinusetheJEVnegtivewhitemouseserum 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LA艘的建立与E基因抗原域的原核表达3．4中和试验3．4．1疫苗毒TCID∞的测定结果BHK．21接种各稀释度的疫苗毒后，产生CPE的情况如下(表2．13)：表2．13接种JEVFC792株后细胞病变情况Table2·13CPErecordingofJEVFC792strain根据Reed．Muench法计算，JEVFC792株细胞毒的TCID50为：10’588／0．1mL。 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达3．4．2免疫重组蛋白E。小鼠血清中和疫苗株SAl4．14．2的结果3．4．2．1免疫E。后小鼠血清中相应抗体的ELISA检测结果二免后一周，小鼠眼球采血、分离血清，用包被JEV全病毒的ELISA试剂盒检测是否有抗E。的抗体产生。结果表明免疫500}tg、2001上gE。蛋白的实验组10只小鼠血清ELISA检测均为阳性，免疫50lxgEA蛋白的实验组10只小鼠中有6只ELISA检测为阳性，免疫10斗gE。蛋白的实验组10只小鼠中有2只ELISA检测为阳性，其余为阴性，而对照组lO只则均为阴性(表2．14)。说明根据设计的免疫程序，免疫重组蛋白E。后，小鼠体内会出现抗E。的抗体，且当重组蛋白E。的免疫剂量达到2001xg时能够产生较高的抗体水平。表2一14免疫重组蛋白Ea后抗体产生结果Table2—14AntibodiesresultsinimmunereorgainizationofproteinEa 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达3．4．2．2中和试验结果选取经ELISA检测为阳性的一份小鼠血清和一份检测为阴性的小鼠血清做JEV的中和试验，同时设立JEV病毒毒力试验对照、血清对细胞的毒性对照和正常空白BHK．21对照。根据细胞病变情况(表2．15)，采用Reed．Muench法计算，对于JEVFC792株，所使用的经ELISA检测为阳性的小鼠血清具有中和JEV病毒的能力，其50％中和效价为1：70，而阴性小鼠血清则无中和JEV的能力。说明重组蛋白E。具有较好的免疫原性。表2．15中和试验细胞病变情况Table2-15Thecytopathicofandexperimental100 硕士论文广西猪JEvFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达4．讨论JEVE基因序列己被认为与病毒的毒力有关。E蛋白是决定病毒毒力表型的关键，单一的氨基酸替代就可能导致的毒力或者神经侵染性的消失【28，291。E蛋白大部分存在于毒粒表面，其形成的表面抗原决定簇，能够诱导宿主机体产生中和抗体、血凝抑制抗体以及补体结合抗体等。日本学者研究发现，抗JEVE蛋白的特异性单克隆抗体具有很高的中和活性，对JEV感染有很强的保护作用。E蛋白具有6个诱导机体产生抗JEV免疫反应的重要表位，其中4个为的B细胞表位[19-22】和2个T细胞表位[23,24】。Kolaskar等【261对E蛋白氨基酸分析，发现E蛋白具有3个抗原域：抗原域I，即中心域，由氨基酸残基1．51、137．196和293．311位共计128个不连续的氨基酸残基组成，域I内具有生物活性及血清学的抗原表位，E蛋白唯一的一个糖基化位点也存在于抗原域I；抗原域II，即二聚体化功能域，它由52—136和197．292位共计171个氨基酸残基所组成，抗原域具II内具有血凝活性和中和活性的抗原表位；抗原域III，由310．411位的连续的100个氨基酸残基组成，研究发现其与受体结合有关。JEVE蛋白的抗原域I和抗原域II与JEV的毒力、保护性免疫等息息相关，因此本研究扩增编码E抗原域I和抗原域II的基因，连接原核表达载体进行原核表达，对重组蛋白进行纯化复性，免疫小鼠后检测相应抗体的产生，并用小鼠血清进行病毒中和实验，研究免疫E蛋白抗原域I和抗原域II后产生抗体中和JEV的能力。4．1原核表达载体的选择T7表达系统是目前所有原核表达系统中应用最多的表达系统，而pET系列则是典型的代表，其中pET-32a是T7表达系统的经典代表，目前被广泛应用于各种原核表达。pET-32a表达载体含有T7启动子和Amp抗性基因，受lac阻抑物的调节，在对数生长期(OD60嘶=0．6)加入适量的IPTG诱导剂后基因开始表达其N端带有6xHis，这为蛋白的纯化提供了方便。4．2原核表达系统的选择在原核表达系统中常用的表达系统有：大肠杆菌表达系统、沙门氏菌表达系统以及链霉菌表达系统和芽抱杆菌表达系统等。因为大肠杆菌表达系统具有以下lOl 硕士论文广西猪JEvFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达特点：目的基因表达水平较高，培养周期短以及抗污染能力强等，而且产生的融合蛋白比较稳定，一般不会被快速降解，且有利于纯化回收，因此它是最为常用的表达系统。本为了能使目的基因能成功地克隆和构建原核表达载体，实验选取pET-32a作为表达载体、选取大肠杆菌表达系统作为表达的宿主菌，奠定了下一步的蛋白质表达的基础。4．3表达质粒的构建表达质粒的构建是目的蛋白得以表达的基础和关键。构建表达质粒时，在克隆位点处两个限制性内切酶不应太接近，太近会降低内切酶的酶切效果，也不利于目的基因与表达载体的连接。BamHI和HindlII是pET-32a上相距较远的两个酶切位点，目的基因上没有BamHI和HindIⅡ的酶切位点，因此本实验选择BamHI和HindIII作为克隆位点，在设计的引物的两端分别添加BamHI和HindIII的酶切位点序列，并添加相应的保护碱基，以保证酶切效率。pET032a空载体与目的基因的连接时原核表达载体构建的关键步骤，目的基因与载体的浓度，以及目的基因与载体的比例都关系着连接反应的效果，因此，应根据目的基因的大小选择合适的载体和供体的比例。4．4原核表达条件的优化BL．21(DE3)是经过人工改造的大肠杆菌宿主菌，BL．21(DE3)缺乏了Ion和ompT这两种蛋白酶，因此表达的外源蛋白在BL一21中通常相较于其他非BL一21衍生菌要更加稳定，其表达量通常也较高。因此，BL．21是一种较为理想的原核表达宿主菌。本实验将构建好的原核表达质粒pET-E。转化进大肠杆菌BL．21(DE3)中，经过IPTG浓度、诱导温度、诱导时间以及调整恒温摇床的转速等表达条件的优化后，目的蛋白始终未能表达。对E。基因序列进行分析后发现，其序列上带有多个大肠杆菌的稀有密码子。这些密码子主要涉及到脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和精氨酸等，对Ea的氨基酸序列进行分析发现，这四种氨基酸分别占到3．77％、8．09％、4．04％和3．50％，共计19．4％，这可能是pET-E。未能在BL．21中表达的原因。Rosetta(DE3)相对与BL．21(DE3)以质粒的形式带有了大部分大肠杆菌102 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT-LAMP的建立与E基因抗厨H式的原棱毒遮的稀有密码子，包括ATA、AGA、AGG、CCC和CTA等，这使之更利于含稀有密码子多的外源基因的表达，随后将重组质粒转化进Rosetta(DE3)中，目的基因得到表达，但表达量不是很高，这增加了获得大量的免疫用重组蛋白的难度。4．5重组蛋白的纯化与复性经过诱导温度、摇床转速以及降低IPTG浓度等条件的优化，发现重组蛋白始终以包涵体的形式得到表达。外源蛋白在Rosetta中的表达，由于表达量过高或者表达速度过快，以至于没有足够的时间去进行正确的折叠，再加上Rosetta中缺乏一些翻译后修饰的酶类，外源蛋白通常以包涵体的形式得到表达。通过对诱导条件的优化，可能会得到可溶性的表达，但未能获得可溶性表达。以包涵体形式表达的外源蛋白虽然其生物学活性差，但包涵体中的蛋白主要为目的蛋白，利于后续蛋白的纯化。本实验采用Ni2+亲和层析法纯化重组蛋白，其原理是用结合与树脂上的Ni2+离子与重组蛋白上的多聚组氨酸结合，重组蛋白上带有6xHis标签，能够很好的和Ni2+结合，而杂蛋白则不能结合在树脂上。但包涵体中的重组蛋白只有在变性的情况下，其两端的多聚组氨酸标签才能够暴露出来，后续的纯化才能进行。变性剂的种类有很多，其中8M的尿素是最常用的一种变性剂，其为中等强度的变性剂，但有时会出现难以溶解包涵体的情况出现。本实验首先选用8M的尿素最为变性剂，发现包含体能够很好的溶解。在纯化时，收集穿透液进行SDS．PAGE电泳，发现穿透液中的重组蛋白也非常少，故选用8M的尿素来作为包涵体蛋白的变性剂。变性纯化后获得的重组蛋白E。不具有生物学活性，必须经过复性与重折叠。本实验采用梯度透析的逐渐去除变性剂尿素，同时在复性液中加入精氨酸、甘油、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽等抑制蛋白聚集、促使蛋白正确折叠的试剂，让变性的蛋白重新得到正确折叠。4．6复性重组蛋白E。的免疫原性和免疫保护性本实验起初设计将复性浓缩的Ea蛋白免疫小鼠，待抗体产生后用JEV分离株FC792进行接种，进行动物保护性试验，分析E。是否与JEV的免疫保护性有关，探索E。免疫后主动保护的效果，但试验发现小鼠(10-159的昆明小白鼠)103 硕士论文广西猪JEVFC792分离捌‘全基因序列的测定与分析反RT—LAMP的建立与E基因抗周u表的原核表达在腹腔配合脑内接种JEVFC792株后并未出现预期的小鼠发病死亡的结果，可能是由于分离到的JEVFC792株为弱毒株的缘故。JEVFC792株虽然接种小鼠不能引起小鼠发病死亡，但感染BHK．21细胞后会出现JEV感染后典型的细胞聚集、变圆和脱落等现象。因此，本实验先用重组蛋白E。免疫小鼠，后采集小鼠血清，用包被JEV全病毒的ELISA试剂盒检测抗E。抗体的水平，将阳性的小鼠血清进行倍比稀释后在BHK-21上做病毒的中和实验，判断抗E。抗体是否具有中和JEV病毒的中和能力，以判断E基因抗原域I和抗原域II的免疫保护性。5小结5．1同时克隆出E基因中包含抗原域I和抗原域II的基因片段E。，并成功构建出重组原核表达质粒pET-32a-Ea，并在Rosetta菌株中得到表达；5．2用JEV阳性猪血清对重组蛋白E。进行Western-blot分析，初步确定其具有抗原性；将纯化后的重组蛋白进行复性，用接种JEV疫苗株的阳性小鼠血清进行Western．blot，确定纯化复性后的具有抗原性。5．3将重组蛋白免疫小鼠后，ELISA检测结果表明免疫小鼠体内产生了抗E。的抗体。固定JEVFC792的含量，将小鼠血清倍比稀释后，在BHK-21细胞上做JEV的中和试验，结果表明免疫E。的阳性小鼠血清具有中和厄V的作用，其50％的中和抗体效价为l：70，说明E。具有较好的免疫原性。 硕士论文广西猪JEvFC792分离株全基因序列的测定与分析反RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达第三章全文结论1本研究完成了对JEV广西分离株FC792株的全基因组序列测定，FC792株全长10977个核苷酸，其中5’非编码区有95个核苷酸，3’非编码区有586个核苷酸，开放阅读框含10296个核苷酸，共编码3432个氨基酸。2FC792株SAl4．14．2和YUNNAN0901株核苷酸同源性为99．7％和99．6％，氨基酸同源性分别为99．4％和99．2％。3遗传进化分析表明FC792株属于基因Ⅲ型，且与YUNNAN0901和SAl4—14．2株的遗传进化关系最为接近。4FC792株与YUNNAN0901株核苷酸的差异率仅为0．45％，氨基酸差异率为0．76％，结构蛋白含有5个氨基酸的差异。5本研究建立了JEVRT-LAMP检测方法，其特异性强，敏感度高，其检测极限为O．5pg的RNA。RT-LAMP反应结束后可以通过添加SYBRGreenI进行可视化观察，大大缩短了检测时间。6克隆了FC792株E基因的抗原域抗原域I和抗原域II的基因片段Ea，成功构建出重组原核表达质粒pET-32a-Ea。经Western-blot分析，初步鉴定重组蛋白Ea具有抗原性。7纯化、复性、浓缩重组蛋白Ea用于免疫小鼠，获得了含有抗Ea重组蛋白抗体的小鼠血清，用抗Ea的小鼠血清倍比稀释进行JEV的中和试验，证明免疫组小鼠血清具有中和JEV的能力，其中和抗体效价为1：70，说明Ea具有较好的免疫原性。 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硕士论文广西猪JEVFC792分离栋全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达JEJEV咖RNACmIU’-I’CRlmnested—PCRgmlmmol／LrainSPBS止rpmmghDNAVbppgBHK．21cellSPFAmpDM匝M岬TCIDsoCPELATJapaneseencephalitisJapaneseencephalitisvirusnanometerribonucleieacidcentimeterreversetranscriptionpolymerasechainrEactionreversetranscriptionnestedpolymerasechainrEactiongrammillilitermillimole／literminutesecondphosphatebufferedsolutionmicrolitrerevolutionsperminutemilligramhourdeoxyribonucleicacidvoltbasepairpicogrambabyhamsterkidneycellspecific-pathogenfreeampicillindulbecco’smodifiedEagle’smediummicrometermediantissuecultureinfectivedosecytopathiceffectlatexagglutinationtest乙型脑炎乙型脑炎病毒纳米核糖核酸厘米反转录多聚酶链式反应反转录套式多聚酶链式反应克毫升毫摩尔，升分钟秒磷酸盐缓冲溶液微升辕|贪毫克小时脱氧核糖核酸伏碱基对皮克幼地鼠肾细胞无特殊病原体氨苄青霉素达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基微米半数组织培养感染量细胞病变效应乳胶凝集试验120 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的澳I定点r分析反RT—LAMP的建立与E基因抗厨油lE的原棱罩【j墨致谢三年研究生的学习生活即将结束，这也意味着我即将毕业，在这个阶段里，我的导师黄伟坚教授为我的学习、生活、课题倾注了大量的心血，没有导师的辛勤栽培、孜孜教诲，就没有我论文的顺利完成。是导师让我明白了做任何事情都要有严谨细致、一丝不苟的精神，在导师这样的熏陶下度过宝贵的三年研究生时光实是荣幸至极，在此，我对我的导师黄伟坚教授表示衷心地感谢!其次，还要感谢广西壮族自治区兽医研究所对本论文完成的无私地支持与帮助，感谢赵武老师对我的悉心教导，感谢秦毅斌师兄对我的指导与无私的帮助!同时，也感谢刘芳老师、韦英益老师，感谢两位老师对我学习和生活上耐性的指导和无私的帮助，他们无私奉献的敬业精神令人佩服。在此也感谢罗廷荣、陆芹章、廖素环、蹇慧、王晓丽老师感谢他们这些年来给我的指导和帮助，正是由于有了他们的帮助，我才能够在各方面取得进步。另外，也要感谢张宁、侯韶毅、肖爱欢、何苹萍、李茂宁、兰家暖、唐海波、孙石开、蔡新斌、黄福标、张民秀、何奇松、周松峰、毛燕、孙翔翔、林俊、刘磊、郭旋、肖雄、刘欢、黎木兰、曾瑜、王艺、陈静、洪绍锋等师兄、师姐、同学、师弟、师妹们的关心和帮助，正是由于有了他们的帮助，我的实验才能顺利地完成，在这里我对他们表示我最诚挚的谢意!最后，还要感谢我的家人及朋友正是由于他们生活上的鼓励和支持，才使得我顺利地完成了大学和研究生的七年的学业。衷心地感谢每一个曾经帮助过我的人!121 硕士论文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的莰I定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原核表达发表的文章【l】李茂宁，秦毅斌，卢冰霞，等。广西猪乙型脑炎病毒的分离及初步鉴定[J】．南方农业学报，2011，42(9)：1151．1156．【2]黄福标，卢冰霞，刘磊，等。屠宰猪肠道沙门氏菌的分离鉴定、耐药性分析及致病性试验【J]．中国畜牧兽医，2012，39(1)：172-177．【3]秦毅斌，赵武，卢冰霞，等。一起乙型脑炎所致猪繁殖障碍病例的确诊[J]．广西畜牧兽医，2011,27(6)：326．328．【4】秦毅斌，何颖，何苹萍，李斌，卢冰霞等。广西猪乙型脑炎血清流行病学调查分析【J]．南方农业学报，2011，42(6)：668．671．【5]李斌，秦毅斌，赵武，何苹萍，卢冰霞等．广西山羊乙型脑炎血清流行病学初步调查分析[J】．广西畜牧兽医，2011,27(3)：142．144． 硕t啼鲁文广西猪JEVFC792分离株全基因序列的测定与分析及RT—LAMP的建立与E基因抗原域的原棱表达个人简历卢冰霞，女，汉族，广西桂平人，1986年09月生，中共党员。求学经历：1999年9月——2001年7月2001年9月——2002年7月2002年9月——2005年7月2005年9月——2009年7月2009年9月——2012年7月攻读硕士学位期间参加科研项目：广西桂平市木根镇第一中学；广西桂平市二中；广西玉林高中；广西大学动物科学技术学院，动物医学专业；广西大学动物科技学院，预防兽医学专业研究生。l、广西科技攻关项目“肉猪主要疫病防控技术研究与示范项目”(桂科攻1123007．3)：2、广西自然科学基金课题“建立诊断猪流行性乙型脑炎的胶体金免疫层析法的研究”(2011G烈SFB018032)；3、公益性行业(农业)科研专项经费项目“边境地区动物疫病防控技术体系研究”的子课题——猪乙脑防控技术体系研究(项目编号201103008)。