半乳糖凝集素-3在舌癌侵袭和转移中的作用及机制研究

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1、山东大学博士学位论文半乳糖凝集素--3在舌癌侵袭和转移中的作用及机制研究姓名：张东申请学位级别：博士专业：口腔临床医学指导教师：魏奉才2012-09-06山东大学博士学位论文半乳糖凝集素．3在舌癌侵袭和转移中的作用及机制研究博士研究生：专业：导师-张东口腔颌面外科魏奉才中文摘要目的：舌癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，在我国约占全部口腔癌的40％。舌癌复发、转移率高，临床预后较差。尽管近几十年来其治疗方法不断得以改进和完善，但患者的五年生存率并未得到显著提高。肿瘤的局部复发和区域性淋巴转移是舌癌患者治疗失败的主要原因，而肿瘤细胞的迁移和

2、侵袭是肿瘤转移和复发过程中的重要因素，因此有关肿瘤细胞迁移和侵袭机制的研究成为该领域的热点之一。半乳糖凝集素．3(galectin-3，Gal-3)为半乳糖结合蛋白家族成员，具有多种生物学功能，在许多肿瘤细胞的迁移和侵袭过程中起重要作用。研究发现Gal-3舌癌组织中过表达，但其在舌癌侵袭转移中的作用和确切机制尚不十分清楚。近年研究发现，Gal-3在某些肿瘤组织中的表达与D．catenin有关。由于13-catenin是经典Wnt信号传导通路中的关键调控因子，因此我们猜测Gal-3可能通过wn邮．catenin信号传导通路调控舌癌细胞的迁移

3、和侵袭。本课题采用免疫组织化学染色对76例舌癌组织标本中Gal-3的表达进行分析，结合临床资料研究Gal．3表达与舌癌相关临床病理因素的关系；应用RNA干扰技术沉默人舌癌细胞系SCC．4和CAL27中Gal-3基因，研究其在舌癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用；通过检测Gal-3基因沉默前后Wn邯一catenin信号传导通路中关键因子表达水平的改变，探讨Gal-3在舌癌细胞中表达与Wnt／13．catenin信号传导通路的关系，旨在为进一步阐明舌癌的侵袭和转移机制提供新的理论依据。方法：1．采用免疫组织化学sP法，对2005～2010年于山东

4、大学齐鲁医院口腔颌面外科就诊的76例舌癌患者肿瘤组织标本中Gal-3的表达进行检测，并结合临床资料分析Gal-3表达与肿瘤分化、临床分期、区域淋巴结转移等临床病理因素问的关系。JJ东大学博士学位论文2．将液氮保存的舌癌细胞SCC．4和CAL27于37。C水浴中快速溶化，用预冷的培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液，在4℃下1800rpm离心10min。弃上清，重悬细胞于新鲜培养液中，SCC．4采用RPMI1640，CAL27采用高糖DMEM培养基进行常规培养。收集对数生长期细胞用于实验。3．采用阳离子脂质体法进行转染。将细胞分为空白对照组、阴性

5、对照组和实验组，按照Invitrogen公司LipofectamineTMRNAiMAX试剂说明书操作，分别将contr01-siRNA和Gal-3．siRNA瞬时转入阴性对照组和实验组细胞，空白对照组细胞不做任何处理。37。C，5％C02条件下培养6h后，替换为含血清的生长培养基。转染后48h，对细胞生物学行为以及相关因子的表达进行检测。4．转染后48h收集各组细胞，采用Trizol法提取总RNA。采用TIANGEN公司QuantscriptRTKit试剂盒，取模板RNA1肛g，加入反转录反应体系，合成cDNA第一链。应用TIANGEN

6、公司ReaIMasterMix(SYBRGreen)试剂盒，以1glcDNA为模板，在7500RealTimePCRSystem中进行扩增，应用SequenceDetectbnSoftwareversion1．4对Gal-3的表达进行分析。以B．肌动蛋白(3-actin)作为内参照。引物序列为：Gai-3上游引物5’．GGCCACTGA．TTGTGCCTI'AT-3’，下游引物5’一T(论AACCTTG从GTGGTCAG．3’；3-actin上游引物5’一CTCCTC—CTGAGCGCAAGTACTC．3’，下游引物5’一TCCTGCTT

7、GCTGATCCACATC．3’。5．转染后48h收集细胞，用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白。采用BCA法进行蛋白定量。取50岭蛋白上样，12％SDS—PAGE胶垂直电泳后电转移至PVDF膜，用5％脱脂奶粉封闭过夜，加入1：1000兔抗人Gal-3多克隆抗体，4"C反应过夜，TBST洗膜，加入1：2000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育2h，ALP显色。扫描、分析Gab3蛋白的表达。以3-actin作为内参照。6．采用MTT法检测细胞的增殖能力。细胞接种于96孔板，每孔细胞数约为2．0×103。37℃，5％C02条件下过夜，细

8、胞达到铺满30～50％时进行转染。分别于转染后0h、24h、48h和72h在每孔加入CCK．810gl，继续常规培养4h。用酶标仪测定在450rim处的吸光度(OD值)，记录结果。以时间为横轴