cripot-1在食道癌侵袭转移中的作用和机制研究

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1、重庆医科大学博士学位论文Cripot--1在食品癌侵袭转移中的作用和机制研究姓名：黄春申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：傅仲学201205重庆医科大学博士研究生学位论文Cripto．1在食管癌侵袭转移中的作用和机制研究目的：摘要食管癌是危害人类健康的全球性公共疾病，是具有侵袭和转移特性的恶性肿瘤之一。虽然近些年来在食管癌的诊断和治疗上取得了一些进展，但由于其复发和转移率高，所以食管癌患者预后情况依然不容乐观，其整体生存率不到10％，术后5年生存率也只有20％一40％。目前普遍认为食管癌是多基因相关，多

2、因素作用，多阶段发展的疾病，其发生和发展的内在确切机制仍未完全阐明。人类肿瘤相关死亡的90％原因是由于肿瘤转移，恶性肿瘤转移是一个多步骤的连续过程，存在其规律和器官选择性。多项研究证实，上皮问质转化(Epithelialmesenchymaltransition，EMT)在恶性肿瘤侵袭和转移中扮演着重要角色。近年来Cripto．1在肿瘤侵袭和转移中的作用越来越受研究者关注，Cripto．1能够促进肿瘤EMT的发生，从而在肿瘤的发生发展过程中起着重要的癌基因作用。因此，本课题通过研究Cripto一1在食管癌侵

3、袭和转移中的作用及其机制，探讨食管癌发病的分子机制，为其早期诊断及分子靶向治疗提供研究切入点和参考。方法：研究Cripto．1在人食管癌组织中的表达及临床意义：收集41例术中食管癌标本，记录患者临床资料，采用免疫组化、Westernblot、重庆医科大学博士研究生学位论文RT-PCR方法检测人食管癌组织、癌旁组织和正常食管组织中Cripto一1，E．cadherin，N．cadherin，Vimentin的mRNA和蛋白表达，探讨其表达水平与食管癌分化程度和淋巴结转移等之间的关系。构建并筛选能够有效抑制人食

4、管癌Ecal09细胞Cripto-1表达的siRNA序列：分别设计针对Cripto一1靶基因序列的3个siRNA序列，构建重组shRNA质粒，并转染至人食管细胞癌细胞Ecal09，以空载体为阴性对照。采用WB和实时荧光定量PCR分别从蛋白和mRNA水平两个水平证实沉默效果，并筛选出干扰效率最高的shRNA。靶向沉默Cripto．1基因对食管癌EMT的影响：将食管癌细胞Ecal09分为干扰组、阴性对照组、空白组。干扰组加入pSilencer2．1·Criptol—shRNA413，阴性对照组加入pSilenc

5、er2．1阴性对照，空白对照组不予任何处理。转染后采用Westernblot和实时荧光定量PCR检测E-cadherin，N．cadhefin，Vimentin蛋白和mRNA的表达变化情况。靶向沉默Cripto．1基因表达及联合应用紫杉醇和顺铂对人食管癌细胞增殖、侵袭、周期、调亡的影响，从细胞水平探讨Cripro．1对食管癌生物学行为的影响：将人食管癌细胞Ecal09分为5组：干扰组、药物组、干扰+药物组、阴性对照组、空白对照组，干扰组加入pSilencer2．1一Criptol—shRNA413；药物组加

6、入顺铂+紫杉醇；干扰+药物组加入pSilencer2．1一Cript01．shRNA413+顺铂+紫杉醇；阴性对照组加入pSilencer2．1阴性对照；空白对照组不予任何处理。平板克隆形成实验重庆医科大学博士研究生学位论文(CFA)检测各组食管癌细胞克隆形成能力；流式细胞术(FCM)检测各组细胞周期、凋亡情况；Transwell小室检测各组细胞侵袭、迁移活力。结果：免疫组化结果显示Cripto一1在食管癌组织中表达增高，且Cripto．1阳性表达者淋巴结和远处转移发生率高，多为临床中、晚期；Cripto．

7、1阴性表达者淋巴结和远处转移发生率低，多为临床早期。其表达与患者的年龄、性别、浸润深度无显著相关性(尸>0．05)，而与淋巴结转移、远处转移及临床分期显著相关(P

8、检测3个shRNA序列对Cripto一1基因沉默均有效，其中pSilencer2．1／Cripto一1shRNA-413的沉默效果最为明显，WB检测的结果与FQ．PCR的一致。选择沉默效应最高的siRNA序列包装shRNA质粒载体，质粒浓度为lug／uL。成功转染pSilencer2．1／Cripto-1shRNA一413至人食管癌Ecal09细胞后，干扰组与对照组和空白组相比，经实时荧光定量PCR和WB检测N．