rnai抑制g6pd表达对胃癌sgc-7901细胞的影响及相关机制研究

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1、密级——博士学位论文RNAi抑制G6PD表达对胃癌SGC．7901细胞的影响及相关机制研究TheEffectandMechanismofInhibitingG6PDExpressioninHumanGastricCancerSGC-·7901byRNAInterference作者姓名：学科专业：学院(系、所)：指导教师：王吉旭外科学湘雅医院陈子华教授答辩委员会主席／中南大学2012年4月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其

2、他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：—呈j够学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。储虢一翩签名

3、幽吼一年』月埤日博士学位论文中文摘要摘要背景：胃癌在我国乃至全世界都是最常见的恶性肿瘤之一。尽管近年来人们在胃癌的诊断和治疗上均取得了长足的进展，但胃癌患者，尤其是进展期胃癌患者的预后仍然较差，术后5年生存率不足25％。G6PD是磷酸戊糖途径的第一个限速酶，其催化产生NADPH和R5P。前者的主要功能在于维持细胞内氧化还原状态的稳定、保护细胞免受氧化应激的损伤；而后者是核酸合成必不可少的原料之一。因此，对于正在分裂增殖的细胞，尤其是快速繁殖的肿瘤细胞来说，充足的NADPH及R5P供应是维持其生长繁殖不可或缺的因素。G6PD在肿瘤中的

4、作用是目前关注的热点。现已证实，G6PD在多种肿瘤组织中高表达，并在这些肿瘤的发生发展过程中发挥了巨大的作用，但其在胃癌组织中的表达及在胃癌发生发展中的作用尚缺乏深入研究。p53是一种重要的抑癌基因，它可使DNA受损伤的细胞停滞在Gl期，使细胞在进入S期前赢得时间修复受损的DNA，而一旦DNA不能被修复，则诱导细胞发生凋亡，防止发生基因突变和染色体畸变的细胞继续繁殖引起肿瘤发生。近来研究发现p53蛋白与细胞内氧化还原状态间存在错综复杂的相互作用并且能提高组织中磷酸戊糖途径的活性。这提示我们，p53与G6PD间可能存在某种必然联系，此

5、联系可能对肿瘤的发生发展产生重要影响。目的：探讨G6PD在胃癌进展过程中的作用及其可能机制。方法：1．采用免疫组织化学方法检测24例胃癌组织及相应正常胃粘膜组织(距肿瘤距离>6cm)中G6PD和突变型p53蛋白的表达情况，然后采用相同方法检测167例胃癌组织中G6PD和突变型p53蛋白的表达情况，分析胃癌组织中G6PD的表达与胃癌患者临床病理因素、预后及胃癌组织中突变型p53蛋白表达间的关系。2．针对G6PD基因设计并合成三对不同序列的经化学修饰的博士学位论文中文摘要siRNA，对胃癌SGC．7901细胞的G6PD基因进行特异性沉默

6、，然后分别检测被不同序列的siRNA干扰后的胃癌SGC．7901细胞中G6PDmRNA的表达量，从而筛选出抑制效率最高的序列，并将其构建成G6PD基因特异性的shRNA表达载体(pGPU6／GFP／Neo。G6PDshRNA)。3．借助脂质体将pGPU6／GFP／Neo．G6PDshRNA表达载体转入胃癌SGC．7901细胞。实验分为空白对照组(未转染的胃癌SGC．7901细胞)、阴性对照组(转染阴性对照表达载体pGPU6／GFP／Neo．shNC的胃癌SGC．7901细胞)和转染组(转染pGPU6／GFP／Neo．G6PDshRN

7、A表达载体的胃癌SGC．7901细胞)。分别采用realtimeRT-PCR法和Westemblot法检测G6PD和p53mRNA和蛋白表达的变化，荧光探针法检测ROS的变化，比色法检测GSH的变化，噻唑蓝法(MTT)观察细胞生长，流式细胞仪检测细胞周期，并用H202诱导氧化应激，观察细胞对氧化应激诱导的凋亡的敏感性的变化。结果：1．与正常胃粘膜组织相比，胃癌组织中G6PD和突变型p53蛋白均呈高表达(尸

8、组织中G6PD和突变型p53蛋白表达呈正相关(r---0．528，P