hsu1f-1基因抑制肝癌smmc-7721细胞迁移和增殖的机制探讨

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1、第二军医大学硕士学位论文hSu1f--1基因抑制肝癌SMMC--7721细胞迁移和增殖的机制探讨姓名：刘虎申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：杨家和201205。摘要研究背景与目的：肝癌的发生发展和转移与多种基因的突变和表达改变密切相关，与多种信号通路的激活或抑制密切相关。硫酸乙酰肝素(hcparinsulfate，HS)，又名葡糖胺聚糖链，是具有电负性的大分子线性聚合物，通过共价键与核心蛋白的丝氨酸甘氨酸残基结合，构成硫酸乙酰蛋白聚糖(HSPG)。HSPG是胞外基质中调控肝素结合生长因子信号通路的重要组成成分。而hSu

2、lf-1是可降解乙酰肝素的内硫酸酯酶，是一个新的肿瘤抑制因子，可能参与肿瘤发生发展过程。P13K／AKT与ERK信号通路对于维持和促进细胞生长、增殖、凋亡等是必不可少的。本研究用病毒感染方法使hSulf-1在肝癌细胞系SMMC·7721中重新表达，观察是否能够降低P13K／AKT、ERK等信号通路蛋白的表达，抑制细胞的增殖、迁移，并研究hSulf-1在肝癌组织及其癌旁组织中的表达和临床意义，进一步探讨hSul￡1抗肝癌的作用及其可能的机制。方法：1．培养SMMC．7721细胞，并以不同的感染复数(MOI)，即MOI=50和1

3、00感染hSulf-1腺病毒，以Ad．EGFP为对照病毒，MOI=50：空白组为空白对照；2．感染48h后收集细胞提取蛋白，Westernblot分析P13K／AKT及ERK通路等信号蛋白表达变化情况；3．利用划痕实验，将相关病毒以上述感染方式感染SMMC．7721细胞，划痕后48h检测hSulf-1对SMMC．7721细胞迁移能力的影响；4．MTT检测相关病毒感染48h后，hSulf-1对SMMC．7721细胞增殖情况影响；5．收集70例HCC组织样本经临床病理分期分级后，以免疫组织化学方法检测HCC组织和癌旁组织中hSu

4、lf-1的表达情况，分析hSulf-1表达与患者临床病理参数之间的相关性，统计各组病人的生存时间并绘制生存曲线。结果t1．WB结果表明Ad．hSulf-1感染组较空白组及对照空病毒组相比，hSulf-1蛋白表达增高，p-AKT、P．ERK等蛋白表达降低，PTEN蛋白表达增高，MOI=100较MOI=50效果更明显。2．戈0痕试验结果表明空白对照细胞迁移距离为637士30．5um，Ad．EGFP感染48h后细胞迁移距离为470-a：60．8um，Ad．hSulf-1处理48h后，SMMC．7721细胞迁移距离为317士51．3

5、um(MOI=50)，233士32．1um(MOI=100)，hSul￡l处理后的细胞迁移距离明显降低。3．MTT结果显示，Ad．EGFP(MOI=50)和Ad．hSulfl(MOI=50和100)处理48h后SMMC一7721细胞的增殖抑制率分别为27．37％、33．84％、47．81％。4．免疫组化结果显示，hSulfl表达于细胞浆，染色均匀。70例肝癌组织标本中，阳性率为100％，其中高表达为17例，高表达率为24．3％；相应癌旁组织中阳性率为100％，其中高表达31例，高表达率为44．3％。hSul‘l的表达与患者肝

6、硬化及病理分级等临床病理参数之间具有相关性，生存分析显示hSulBl高表达的患者中位生存期为38个月，低表达患者中位生存期为27个月。结论：1．hSul￡l能够降低肝癌细胞系中AKT及ERK磷酸化水平，下调P13K／AKT、ERK等信号通路活化程度，抑制SMMC一7721细胞的迁移和增殖。hSulol可能通过抑制细胞的增殖和侵袭能力来抑制肿瘤的形成。2．hSulfl在肝癌组织中表达较癌旁组织相比降低，且其高表达患者中位生存期较低表达患者延长。hSulGl的表达水平与肝癌患者的生存预后密切相关。3．hSulGl在肝癌的发生、发

7、展过程中可能起重要作用。有望成为肝癌治疗的新靶点。关键词硫酸酯酶基因1，肝癌细胞，细胞迁移，信号传导，细胞增殖，肝细胞癌，免疫组化AbstractBackground&ObjectiveThehumansulfatase1gene(hSulf-1)encodesanextracellular6．O．endosulfataseandregulatesthesulfationstatusofheparansulfateproteoglycans(HSPG)．IthasbeenreportedthathSulf-1hasbeend

8、own-expressedinmanytumors，snchashcpatocellularcarcinoma(HCC)．RecentstudiesindicatedthathSulf-1suppressestumorigenesisandangiogenesisbyinhibitingt