鱼类病毒性出血性败血症病毒单克隆抗体的制备及其核蛋白基因的原核表达

《鱼类病毒性出血性败血症病毒单克隆抗体的制备及其核蛋白基因的原核表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、华中农业大学硕士学位论文鱼类病毒性出血性败血症病毒单克隆抗体的制备及其核蛋白基因的原核表达姓名：杜娟申请学位级别：硕士专业：水产养殖指导教师：陈孝煊；刘荭201206鱼类病毒性出血性败血症病毒单克隆抗体的制备及其核蛋白基因的原核表达摘要本研究利用纯化的病毒性出血性败血症病毒(Xrtralhemorrhagicsepticemiavirus，ⅧSV)以及原核表达的VHSV核蛋白作为免疫原，分别制备了抗VHSV全病毒的单克隆抗体以及抗核蛋白的多克隆抗体，并利用单克隆抗体建立了VHSV双抗体夹心ELISA检测方法。试验结果如下：1．VHSV单克隆抗体的制备及VHSV双抗体夹心ELISA检测方法的

2、建立用纯化的VHSV免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与SP2／0细胞融合，间接ELISA方法筛选阳性孔，再经有限稀释法对其进行克隆，筛选出1株能够稳定分泌抗VHSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2E9。用2E9注射小鼠制备腹水单克隆抗体，ELISA方法测定腹水抗体效价为l：160000。亚型鉴定表明，2E9腹水单克隆抗体为IgG2b亚类，其轻链为lC链。纯化后的2E9腹水单克隆抗体主要包括大小约为50ku的重链和25l(u的轻链。交叉实验结果表明，2E9腹水单克隆抗体只能与VHSV发生特异性结合，与传染性造血器官坏死病毒(Infectioushaematopoieticnecrosisv

3、irtLS，Imw)等均无交叉反应，具有较好的特异性。间接免疫荧光试验结果表明，2E9腹水单克隆抗体能与VHSV发生特异性结合，产生绿色荧光。Westernblot分析表明，2E9腹水单克隆抗体能特异性地与VHSV的核蛋白结合。利用制备的2E9腹水单克隆抗体与羊抗VHSV阳性血清建立了VHSV双抗体夹心ELISA检测方法。结果表明，将浓度为2．5mg／mL的纯化的2E9单抗腹水，按1：800倍稀释为最佳的单抗包被浓度，而羊抗VHSV血清工作浓度为1：400。经验证，建立的双抗体夹心ELISA法对IHNV等3种病毒的检测结果均为阴性，表明该方法具有良好的特异性。该法能特异性识别VHSV，检测

4、限约为40ng／mL，具有较高的灵敏度。2．VHSV核蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得了编码VHSV核蛋白基因，将其克隆至原核表达载体pET28a，并在EcoliBL21(DE3)中得到了表达，用SDS—PAGE与Westernblot对表达产物进行鉴定。结果表明，通过RT-PCR扩增获得长度为1221bp核蛋白基因片段，诱导表达重组质粒pET28a-N，经SDS—PAGE检测，IPTG终浓度为1mmol／L时，诱导5h蛋白表达量最高，获得的目的蛋白大小与N蛋白的预测分子质量一致，约为48ku。诱导后的菌液进行超声波破碎后，将沉淀和上清分别用

5、于SDS．PAGE电泳，结果表明目的蛋白主要以包涵体的形式存在。表达蛋白经过复性、纯化，得NT较高纯度的可溶性蛋白。经Westernblot检测表明，该表达产物能华中农业大学2012届硕士学位论文被羊抗VHSV阳性血清特异性识别。利用表达的核蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体，间接ELISA法检测表明获得的鼠抗VHSV核蛋白血清效价为1：32000，与VHSV病毒悬液反应强烈。Westernblot分析结果显示，在48l【u处出现一条特异性条带，表明利用表达的核蛋白制备的多抗血清能特异性地识别VHSV的核蛋白。关键词：鱼类病毒性出血性败血症病毒；单克隆抗体：核蛋白；原核表达；多克隆抗体鱼类病毒性出

6、血性败血症病毒单克隆抗体的制各及其核蛋白基因的原核表达AbstractInthisstuty,purifiedV'Lralhemorrhagicse#cemiavirus(VHSV)andVHSVnucleoproteinwereused嬲immunogcnstopreparemonoclonalantibodyanti-VHSVandpolyelonalantibodyanti-nucleoproteinrespectively．1．PreparationofmonoclonalantibodiesagainstVHSVanddevelopmentofdouble-antibodysan

7、dwichindirectELISAtodetectVHSVSpleencellswerefusedwithMousemyelomacells(SP2／0)afterBALB／emiceimmunizedwithpurifiedviralhemorrhagicsepticemiavirus(VHSV)，positivecolonieswerescreenedbyindirect-ELISAandclonedwithlim