自噬抑制绿脓杆菌制剂pa-msha抗乳腺癌细胞增殖作用的研究

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1、复旦大学博士学位论文自噬抑制绿脓杆菌制剂PA--MSHA抗乳腺癌细胞增殖作用的研究姓名：徐闻欢申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：邵志敏2012-04-10自噬抑制绿脓杆菌制剂PA—MSHA抗乳腺癌细胞增殖作用的研究中文目摘要的检测内质网应激、自噬在绿脓杆菌制剂(PA-MSHA，Pseudomooag"aerug／nosa-mannosesensitivehemagglutinin)抗人乳腺癌细胞增殖、诱导凋亡过程中的作用，并深入探讨其机制，以更深入全面的了解PA-MSHA对人乳腺癌细胞的作用机制和耐药机制。方法第一部分1

2、、透射电子显微镜观察PA-MSHA作用后细胞亚结构形态的变化。2、Westernblot法检测PA-MSHA作用后内质网应激相关蛋白水平的变化。3、荧光显微镜观察PA-MSHA作用后乳腺癌细胞内绿色荧光斑点形态的变化情况。4、Westernblot法检测PA-MSHA作用后自噬相关蛋白水平的变化。第二部分1、光学显微镜观察PA-MSHA、自噬抑制剂3-MA作用后乳腺癌细胞形态变化。2、AnnexinV-FITC和PI染色流式细胞计数法、WST法、westernblot检测3-MA对PA．MSHA诱导人乳腺癌细胞凋亡的影响。3、

3、设计并合成针对人IREl基因的shRNA片段，将shiREl片段转入乳腺癌细胞中，Westernblot法验证shRNA下调IREl表达的有效性。4、观察IREl下调后PA-MSHA对自噬水平以及细胞增殖水平的影响。主要采用AnnexinV-FITC和PI染色流式细胞计数法、Hoechst33258染色、westernblot等方法检测IREl对于PA-MSHA引起的抗增殖、细胞凋亡等的影响。2第三部分1、裸鼠乳房脂肪垫(mammaryfatpad，MFP)接种人乳腺癌细胞，建立裸小鼠乳腺原位移植瘤模型。2、通过原位肿瘤大小、

4、生长情况、TUNEL试验和westernblot等探讨PA-MSHA及自噬抑制剂3-MA对裸鼠原位肿瘤生长的影响。结果一部分1、乳腺癌细胞株MDA．MB．231HM细胞体外培养，经PA．MSHA处理后，乳腺癌细胞内部呈现出大量扩张的内质网腔，内质网应激的标志性分子GRP78／Bip和CHOP经westemblot检测表达升高，且呈剂量和时间依赖性。2、乳腺癌细胞株MDA-MB．23IHM细胞体外培养，经PA-MSHA处理后，乳腺癌细胞内部自噬泡数量增多；转染GFP．LC3的细胞胞浆内出现典型的绿色荧光斑点；自噬的标志性分子LC

5、3和ATG5经westernblot检测蛋白表达量升高，且呈剂量和时间依赖性。二部分l、MDA-MB．231、MDA—MB．231HM和MDA．MB-468细胞分别经PA-MSHA，3-MA，PA．MSHA联合3-MA处理48小时后，光镜下观察到PA．MSHA联合3-MA处理组的细胞表现为皱缩、凋亡的细胞形态。AnnexinV-FITC和PI染色流式细胞计数法、WST法、westernblot检测均提示PA-MSHA联合3-MA处理组中细胞凋亡的比例高于单纯PA-MSHA或者3-MA处理组。2、shIREl下调乳腺癌细胞IRE

6、l基因后，MDA．MB．23l、MDA．MB．231HM经PA．MSHA处理，采用ArmexinV-FITC和PI染色流式细胞计数法、Hoechst33258染色、westernblot等方法检测发现shIREl组自噬水平下降，凋亡比例增加。三部分PA．MSHA可以显著抑制小鼠移植瘤生长速度并缩小肿瘤体积大小，shiREl具有提高PA．MSHA减缓移植瘤生长速度的作用。TUNEL试验、westernblot也提示shiREl联合PA．MSHA可以增加移植瘤中凋亡细胞的数量和凋亡相关蛋白的表达。结论PA-MSHA在抑制乳腺癌细胞

7、的生长的同时，可以引起细胞的内质网应激和自噬。PA-MSHA能通过内质网应激中IREI通路激活自噬。自噬降低PA-MSHA抑制乳腺癌细胞生长的能力，抑制自噬可以提高PA．MSHA的细胞毒性作用。关键词：PA-MSHA；乳腺肿瘤；内质网应激；自噬中图分类号：R730．544InhibitingautophagyenhancesPA-MSHAlethalityforhumanbreastcancercellsAbstractToinvestigatetheeffectsofERstressandautophagyonPA—MSHA

8、(Pseudomonasaeruginosa-marmosesensitivehemagglutinin)inhibitingproliferationandinducingapoptosisofbreastCanCel"celllinesandthemechanism，an