脂联素和脂联素抗体通过壳聚糖水凝胶对骨关节炎的影响研究

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1、学校代码：10023学号：200401068脂联素和脂联素抗体通过壳聚糖水凝胶对骨关节炎的影响研究专业年级：北京协和医学院临床医学专业2004级姓名：王维新导师：邱贵兴(教授)北京协和医学院临床学院(北京协和医院)骨科完成日期：2012年6月溉目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4日O舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．骨关节炎⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42．肥胖、脂联素和OA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯．53．壳聚糖温敏水凝胶⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64．实时荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯75．CCK．8细胞增殖与活性检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯106．实验内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11第一部分配制壳聚糖／甘油磷酸水凝胶⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．131．材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯143．结果及讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯154．总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22第二部分脂联素和脂联素单抗刺激软骨细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯231．材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯232．试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．结果及讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯284．总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．37综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯55独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．56中文摘要目的骨关节炎(OA)是常见的关节疾病，发病率高和致残率较高，并且缺乏有效控制病情或逆转病情的保守治疗方法。OA的发病机制尚不完全明确，近年来不少研究发现，力学负荷超载导致机械性的软骨破坏只能部分解释肥胖与OA的联系，肥胖时异常分泌的脂肪因子可能具有重要的病理生理作用。通过对OA发病机制的研究，可以发现OA发生发展中的重要作用因子，探索控制病情的治疗方案，具有重要的临床意义。

5、本研究包括两个部分：1、研究脂肪因子脂联素和脂联素单克隆抗体对软骨细胞的影响。2、配制壳聚糖．甘油磷酸二钠温敏水凝胶，并评估其细胞相容性。方法1、培养软骨细胞，在镜下观察细胞形态，并用脂联素和脂联素单抗刺激细胞，通过荧光定量PCR检测IL-6和胶原蛋白表达量。2、配制壳聚糖，甘油磷酸二钠温敏水凝胶，研究凝胶的温敏特性，并通过CCK．8法评估其细胞相容性。结果1、11．Jg／ml脂联素可促使软骨细胞表达大量的IL．6，较对照组表达量高110倍(P<0．001)，通过换液去除培养基中的脂联素后，IL-6的表达量又明显下降(P<0．001)，提示脂联素可刺激软骨细

6、胞产生

7、L-6。1IJg／ml脂联素单抗刺激软骨后

8、L．6的表达量仅稍高于对照组。质量分数相等的脂联素和脂联素单抗同时刺激软骨细胞，lL．6的表达量与脂联素单独刺激软骨细胞时的表达量无明显差异。提示脂联素单抗没有阻断脂联素与其受体的作用，或者抗体的量相对于脂联素量过小。II型胶原酶的表达量显示，脂联素减少了软骨细胞

9、I型胶原蛋白的表达，而脂联素抗体可以增加Il型胶原蛋白的表达量。2、通过混合不同比例的壳聚糖和甘油磷酸，得到了可以在生理温度下凝固的水凝胶。试验发现，cs含量固定时，胶凝温度随GP的含量增高而降低，胶凝时间随GP的含量增高而缩短。通过CCK．8法

10、评估CS／GP凝胶的相容性，发现在不同量凝胶的刺激下，软骨细胞均可缓慢的增长，而细胞活力在缓慢增长后出现了缓慢下降的趋势。结论1、脂联素可致软骨细胞lL-6表达量增高，并且降低了lI型胶原的表达，在OA的发生发展过程中起到一定的破坏作用。脂联素单抗可能促进软骨细胞表达¨型胶原，对促进软骨基质的生成。2、CSIGP水凝胶可在生理温度下形成温度敏感水凝胶，与软骨细胞共培养时，细胞表现出了一定的活力和增殖力，提示CS／GP可进一步应用于关节腔内注射载药的研究。关键词脂联素、脂联素单抗、骨关节炎、壳聚糖、温度敏感水凝胶ABSTRACTBackgroundandaim

11、s：Osteoarthritis(OA)isachr