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脂联素对TNF刘金波，邓华聪，葛倩，李丙蓉，郑宏庭，兰丽珍【关键词】脂联素；肿瘤坏死因子α；内皮,血管/细胞学；动脉硬化 InfluenceofadiponectinonvascularinflammatoryreactionmediatedbyTNFα LIUJinBo,DENGHuaCong,GEQian,LIBingRong,ZHENGHongTing,LANLiZhen DepartmentofEndocrinology,FirstAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China 【Abstract】AIM:ToinvestigatetheinfluenceofadiponectinontheinflammatoryreactioninvascularendothelialcellsinducedbyTNFα.METHODS:Humanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC)algroup,TNFαstimulationgroupandadiponectinandTNFαassociatedstimulationgroup.HUVECanrebinantadiponectinfor30minto16h,thenexposedtohumanrebinantTNFαfor6to12h(adiponectinandTNFαassociatedstimulationgroup),ulationgroupintheexpressionsofNO,iNOS,ET1andMCP1.Theinteractionbetatedbychemicalmethod,radioimmunoassayandELISA.RESULTS:TheexpressionsofNO,iNOS,ET1andMCP1ulatedbyTNFαfor6to12h(607.7±7.6,42.2±2.2,199.3±11.9,167.7±15.9vs543.5±2.2,23.8±2.0,148.4±5.3,128.0±8.4;P0.05).paredulationgroup,theexpressionsofNO,iNOS,ET1andMCP1inadiponectinandTNFαassociatedstimulationgroupodulateendothelialinflammatoryresponsethrougheffectingtheexpressionsofsomeinflammatoryfactors,andadiponectinhasprotectiveactionsagainsttheinitiationandprogressionofatherosclerosis. 【Keyornecrosisfactoralpha;endothelium,vascular/cytology;arteriosclerosis 【摘要】目的：探讨脂联素对肿瘤坏死因子（TNFα）引起的血管内皮细胞炎症反应的影响.方法：体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）.随机分为对照组，TNFα刺激组和脂联素+TNFα刺激组.HUVEC与脂联素联合孵育一段时间后再给予TNFα刺激与单纯TNFα刺激做对照，分别采用化学法，放免法及ELISA法检测脂联素对血管内皮细胞NO,iNOS,ET1及MCP1蛋白表达的影响.结果：HUVEC经TNFα刺激6~12h后其NO,iNOS,ET1及MCP1蛋白的表达（607.7±7.6,42.2±2.2,199.3±11.9,167.7±15.9）与对照组（543.5±2.2,23.8±2.0,148.4±5.3,128.0±8.4）相比明显增强（P0.05）；当HUVEC在TNFα刺激之前首先与脂联素共同孵育一段时间后，则血管内皮细胞NO,iNOS,ET1及MCP1蛋白的表达（565.7±13.0,36.5±2.7,170.8±8.3,142.6±5.6）与单纯给予TNFα 刺激相比明显减弱（P0.05）.结论：脂联素可以通过抑制血管内皮细胞某些炎症因子的表达水平来调节血管内皮细胞的炎症反应，从而发挥其抗炎，抗动脉粥样硬化的作用. 【关键词】脂联素；肿瘤坏死因子α；内皮，血管/细胞学；动脉硬化 0引言 脂联素（adiponectin）作为一种仅由脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子，因其具有改善胰岛素抵抗、抗炎及抗动脉粥样硬化活性而成为当前研究的热点.体外研究证实，生理浓度范围内的脂联素通过抑制NFкB信号传导通路能够剂量依赖性的抑制肿瘤坏死因子（TNFα）介导的血管内皮细胞黏附分子的表达.因此，设想脂联素对于血管内皮细胞分泌的其他炎症因子有可能也具有相类似的作用.我们通过观察脂联素对血管内皮细胞表达NO,iNOS,ET1及MCP1的影响来进一步明确其抗动脉粥样硬化机制. 1材料和方法 1.1材料人脐静脉内皮细胞株（humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC）购自中科院细胞库；重组人脂联素购自美国R＆D公司；重组人肿瘤坏死因子购自北京宝赛生物技术有限公司；NO检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；内皮素放免试剂盒购于北京东亚免疫研究所；人MCP1ELISA试剂盒购自美国BIOSOURCE公司；722光栅分光光度计，重庆川仪九厂；自动放免仪中国科大中佳公司；BioTEKELX800型酶标仪. 1.2方法 1.2.1细胞培养人脐静脉内皮细胞株培养于含100mL/L小牛血清的RPMI1640培养液中，置于37℃,50mL/L的CO2培养箱中培养，每2～3d用2.5g/L胰酶消化传代.生长至85%融合时接种于96孔细胞培养板，接种细胞密度为1×105个/mL，待细胞贴壁后，改用无血清RPMI1640培养液继续培养24h，弃去旧的培养液后用于下一步实验. 1.2.2脂联素对内皮细胞表达NO,iNOS,ET1的影响①实验分组：按照随机化分组的原则，每组重复5孔.对照组；TNFα刺激组：根据预实验结果确定TNFα终浓度10μg/L;TNFα+脂联素刺激组：根据预实验结果确定脂联素终浓度为10mg/L;10mg/L脂联素作用0.5h后加入10μg/LTNFα.②NO测定：上述干预因素作用6 h后取细胞培养上清液检测，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行.③分型NOS测定：NOS主要有结构型（cNOS）和诱导型（iNOS）两类，cNOS依赖钙，而iNOS不依赖钙，据此可分型.上述干预因素作用6h后取细胞培养上清液检测具体操作严格按说明书进行.④ET1测定：上述干预因素作用12h后取细胞培养上清液检测，采用放免法，I125标记抗原.具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行. 1.2.3脂联素对内皮细胞表达MCP1的影响①实验分组：按照随机化分组的原则，每组重复4孔.对照组；TNFα刺激组：同上；TNFα+脂联素刺激组：加入不同浓度的脂联素（12.5,25,50mg/L），培养细胞16h，再加入10μg/LTNFα继续作用6h；②MCP1测定：取细胞培养上清液100μL,双抗体夹心ABCELISA法检测MCP1蛋白表达，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行. 统计学处理：采用SPSS13.0软件对资料进行分析，多组均数比较采用单因素方差分析（OnehanesT2法.P0.05表示差异具有统计学意义.所有结果均以x±s表示. 2结果 2.1脂联素对TNFα损伤状态下的内皮细胞NO,iNOS及ET1表达的影响TNFα组NO,总NOS,iNOS及ET1表达水平明显高于对照组（P0.01）,cNOS明显降低（P0.01）;TNFα+脂联素刺激组NO,总NOS,iNOS及ET1表达水平明显低于TNFα组（P0.05），但与对照组相比仍明显增高（P0.01）,cNOS明显升高（P0.01），但未恢复到正常水平，说明脂联素可部分逆转TNFα对内皮细胞的损伤作用（表1）. 表1脂联素对TNFα损伤下的NO,iNOS和ET1的影响（略） aP0.05,bP0.01vs对照；cP0.01,dP0.01vsTNFα刺激. 2.2脂联素对TNFα损伤状态下的内皮细胞MCP1表达的影响内皮细胞经TNFα作用6h后其MCP1的表达明显增加（128±8vs168±16,P0.01）；若HUVEC首先经脂联素作用16h，再加入10μg/LTNFα继续作用6h，与对照组相比，低浓度（12.5mg/L）的脂联素未能明显抑制TNFα介导的内皮细胞MCP1表达（165±8vs168±16,P>0.05），高浓度（25mg/L,50mg/L）的脂联素可明显的抑制TNFα介导的内皮细胞MCP1表达（143±6,142±9vs168±16,P0.01）. 3讨论 脂联素具有抗动脉粥样硬化及抗炎作用，其通过直接与血小板衍生生长因子（PDGF）BB结合而抑制其介导的血管平滑肌细胞的增殖及迁移.Chen等〔1〕研究发现脂联素通过磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）途径刺激血管内皮细胞释放NO，并且AMPK磷酸化一氧化氮合酶（eNOS）参与此过程.动物体内研究方面，脂联素基因敲除鼠用金属丝损伤动脉后，出现明显的内膜增厚和血管平滑肌增殖，将表达脂联素的腺病毒载体转染入体内而使其血浆脂联素达到正常水平后，内膜的增厚和血管平滑肌的增殖明显改善〔2〕.Okamoto等〔3〕将含全长的apM1cDNA序列具有表达能力的脂联素腺病毒载体通过尾静脉注入apoE/鼠（鼠动脉粥样硬化模型）体内，2RNA表达水平，而上述炎症因子在动脉粥样硬化的发生发展中具有重要的作用.临床研究方面，检测反应性充血过程中前臂血流量（forearmbloodfloamediathickness,IMT）与心血管疾病的患病率及心血管事件的危险度密切相关，Pilz等〔6〕对140名青少年肥胖者研究发现血浆脂联素水平与颈动脉IMT呈明显地负相关关系（P0.001,r＝-0.34），与高密度脂蛋白及血清载脂蛋白A1呈正相关.NO,ET1及MCP1在动脉粥样硬化的起始阶段发挥重要的作用，TNFα为一重要的炎症介质,在糖尿病及其血管并发症患者中明显升高.我们观察了在体外TNFα对于血管内皮细胞的干预，结果显示，血管内皮细胞经TNFα刺激后，其NO及iNOS表达增加，eNOS表达降低，说明增加的NO主要为iNOS产生的损伤性NO，同时ET1及MCP1的表达也明显增加，进一步证实了TNFα对于血管内皮的损伤.经一定浓度的脂联素作用后，血管内皮细胞NO分泌减少，其中iNOS活性明显降低，eNOS活性升高，且ET1及MCP1表达亦降低，但仍与对照组有差异，说明脂联素可部分逆转TNFα对内皮的损伤.目前大多数研究认为血管内皮细胞eNOS的活性主要受钙离子和PI3K通路的调节，TNFα和脂联素是否也通过上述途径尚需进一步研究.NFκB信号通路作为内皮细胞炎症反应的中心环节，TNFα主要通过NFκB信号通路来介导内皮细胞的炎症反应，提示脂联素也可能作用于NFκB信号通路来发挥抗动脉粥样硬化作用，这有待于进一步研究. 综上所述，脂联素具有抗炎及抗动脉粥样硬化活性，我们通过体外实验也得出同样的结论.脂联素作为脂肪细胞分泌的在血浆中含量最为丰富的脂肪细胞因子，其抗糖尿病、抗炎、抗动脉粥样硬化活性为以后的临床应用提供了可靠的理论依据和广阔的发展空间. 【
