肿瘤干细胞标志物cd133质粒构建及对肝癌细胞生物学特性影响研究

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1、厦门大学硕士学位论文肿瘤干细胞标志物CD133质粒构建及对肝癌细胞生物学特性影响研究姓名：刘鹏申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：吴国洋201207厦门大学医学院2009级硕士毕业论文摘要．肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，我国肝癌死亡率高居世界之首。近数十年来，虽然在手术和放化疗等治疗方面取的了很大的进步，但其远期疗效仍不满意，主要原因是术后肿瘤的复发和转移。肝癌手术后5年复发率高达62％。因此，肝癌转移复发的研究现已成为目前肝癌防治工作中的重点。肝癌的转移是一个多环节，多阶段的过程。通过对肝癌患者原发灶和

2、转移灶的对比研究发现，两者之间具有高度同源性，这提示我们，这部分引起转移的肿瘤细胞具有复制出和原发灶异质性相同的能力。许多研究证实了肿瘤组织中并不是每个肿瘤细胞都具有致瘤性，而是由一部分比例极低的细胞增殖形成的，这部分细胞被称为肿瘤干细胞，并且认为肿瘤干细胞是导致肿瘤发生以及治疗后复发的“根源"。肿瘤干细胞具有：自我更新、分化潜能、高致瘤性、耐药性等生物学特性。目前在对乳腺癌和胰腺癌的研究中发现，肿瘤干细胞(CancerStemCells)是引起肿瘤转移的重要原因。肝癌中肿瘤干细胞的研究才刚刚起步，目前认为，

3、肝癌干细胞的来源可能为肝干细胞或肝祖细胞，即卵圆细胞。最近，一些研究人员利用肿瘤干细胞表面标志物CDl33，从肝癌组织及肝癌细胞系中分离出具有干细胞特性的亚群，为肝癌干细胞的存在找到了新的证据。这些肝癌组织中CDl33+细胞，不仅在体外具有很强的增殖和克隆形成能力，还在免疫缺陷鼠的体内具有明显的成瘤优势；同时，CDl33+细胞具有较高的干细胞相关基因如catenin、Oct一3／4、Bmi、SM0、Notch一1的表达；在体外适当条件下培养，CDl33+细胞能分化为血管内皮样，骨骼肌样或心肌样细胞。人CDl3

4、3蛋白为细胞膜蛋白超家族成员，为一个含有865个氨基酸、分子量约为120ku的糖蛋白。其分子结构包括：细胞外NH2一端，2个大的胞外环状结构，5次跨膜结构域，2个小的富含半胱氨酸胞内环状结构和胞内的一CooH结构本研究主要通过对CDl33基因的提取及过表达的方法，研究CDl33+肿瘤细胞增殖、致瘤性、耐药性及凋亡。研究发现在体外，CDl33+肿瘤细胞具有更强的增殖能力，致瘤性及耐药性。进一步研究发现，过表达CDl33的肿瘤细胞，其细胞内部P13K—AKT被过度激活，从而导致了其增殖能力增强，凋亡减弱。综上，2

5、厦门大学医学院2009级硕士毕业论文我们认为，肝癌中CDl33十细胞具有肿瘤干细胞的特性，是肝癌转移复发的重要原因。靶向CDl33+肝癌细胞将成为肝癌分子靶向治疗的一个新途径。本文主要分为以下四个部分：第一部分，通过收集肝癌细胞系进行筛选发现，并不是所有肝癌细胞系都表达CDl33表面分子，其表达率高低不一。我们通过流式细胞仪检测后，选定Huh7和HepG2两株细胞。Huh7细胞株中CDl33的表达率稳定在70％左右，HepG2细胞株中CDl33的表达稳定在1％以内。通过提取Huh7细胞中CDl33基因序列，构

6、建真核细胞表达载体，转染入HepG2细胞系中，建立稳定表达CDl33的HepG2细胞系(HepG2一CDl33)，另一组HepG2转染空质粒载体，并建立稳定转染细胞系(HepG2一EV)。．第二部分，通过对HepG2一CDl33和HepG2一EV两株细胞的体外对比发现，CDl33组的增殖，耐药能力增强。凋亡减弱。由此推断，CDl33分子具有改变细胞增殖等生物学性状的能力，具有肿瘤干细胞的部分特性。第三部分，对HepG2一CDl33及HepG2一EV两株细胞的体外成瘤比较。通过对免疫缺陷鼠随机分为两组，分别皮下

7、接种同一数量的HepG2一CDl33及HepG2一EV两株细胞，观察记录瘤体大小，3周后将瘤体取出，分别测量大小，重量，进行比较。实验发现，HepG2一CDl33组致瘤性明显强于HepG—EV组，主要表现在瘤体的生长速度方面。第四部分，进行HepG2一CDl33及HepG2一EV两株细胞分子信号通路的研究。分别提取两株细胞的蛋白，进行分子电泳及蛋白质印迹，观察分子信号通路的变化。HepG2一CDl33与HepG2一EV对比发现，CDl33组中的P13K—AKT信号通路被过度激活。这可能是导致HepG-cDl3

8、3细胞株增殖、致瘤增强，凋亡减弱的直接原因。’综上所述，越来越多的肿瘤干细胞研究中将CDl33作为一个标志分子，而CDl33的功能现在却不清楚。本研究通过过表达的方法，将CDl33作为单一的影响因素进行分析，揭示cDl33的生物学功能，发现CDl33表面分子能使肿瘤细胞具有部分肿瘤干细胞特性，靶向CDl33分子可能会成为肿瘤的分子靶向治疗的新途径。关键词：肝细胞癌；肿瘤干细胞；CDl33；表面标志物