紫杉醇富集的肺腺癌始动细胞的异常mirnas表达

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1、第三军医大学博士学位论文紫杉醇富集的肺腺癌始动细胞的异常miRNAs表达姓名：林盛申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：陈正堂201205第三军医大学博士学位论文紫杉醇富集的肺腺癌始动细胞的异常miRNAs表达摘要研究背景非小细胞肺癌(NSCLC)是重要的恶性肿瘤致死原因。近十年以来，随着诊断水平的提高和综合治疗模式(新辅助化疗，高精度放疗以及分子靶向治疗)的改进，使肺癌病员有所受益，但是总体5年生存率改善并不明显。众多研究证实在肿瘤组织中存在着极少数的细胞，被称作癌干细胞或肿瘤始动细胞，它们具备较普通肿瘤细胞更强的自我增殖更新、侵袭及治疗抗拒的能力，是肿瘤复发和转移的根源

2、。癌干细胞存在于大多数实体肿瘤中，并能为某些表面分子所标记；但就肺癌干细胞而言，对其确切的分子表面标记存有争议。CDl33作为目前研究多数肿瘤干细胞的通用分子标记，研究报道认同其作为肺癌组织中干细胞的分子标记物，但就肺癌细胞株(包括A549肺腺癌细胞株)，单独使用CDl33作为分子标记得到的细胞亚群不能视为干细胞，在联合CD326后得到的细胞亚群具备干细胞的相关特性，因此CDl33／CD326可以作为肺癌细胞株干细胞的标记物。也有研究报道利用干细胞的化疗抗性用药物进行筛选，发现存活的细胞亚群具备干细胞的相关特性。大量研究证实miRNAs可作为肿瘤干细胞生物学行为的重要调控因素

3、而广泛参与肿瘤形成和演进的各个环节，扮演癌基因或抑癌基因的角色。因此，更好地了解肺癌干细胞与其相关调控miRNAs分子之间的调控网络，可望为临床肺腺癌发生发展的潜在分子机制提供新的理论支持。目的基于目前鲜有miRNAs分子对肺腺癌干细胞生物学行为调控的研究报道，此研究的目的通过体外无血清培养基逆向诱导联合紫杉醇完成对A549肺腺癌始动细胞的富集；证实富集得到的细胞具备干细胞的相关特性；通过microRNA谱筛选目的细胞亚群与普通肿瘤细胞之间的差异miRNA分子并用定量PCR方法加以验证。旨在建立A549肺腺癌细胞株肿瘤始动细胞的诱导分离方法，了解肺腺癌始动细胞内异常型miRN

4、A分子的表达情况，并部分揭示这些miRNA分子对肺腺癌始动细胞的调控功能。方法1．为了避免肺癌始动细胞分子标记物的争议，采用无血清培养基逆向诱导联合紫第三军医大学博士学位论文杉醇的方法从A549细胞中富集得到肺腺癌始动细胞。将对数生长期的A549细胞胰酶消化，干细胞培养基重悬，得到成球状生长的细胞；在传至第二代时加入紫杉醇(使用浓度：100nmol／L)作用48h，离心去除死细胞和紫杉醇，换以新鲜干细胞培养基，每周视细胞生长状态进行1—2次换液，直到残留细胞重新恢复克隆生长。2．为了验证富集得到的细胞亚群具备干细胞的相关特性，进行相应的在体和体外实验，包括：流式和免疫荧光检测

5、CDl331CD326分子表达情况，免疫组化鉴定球细胞球的分化潜能，裸鼠成瘤及定量PCR检测干细胞相关基因的表达。3．将富集得到的细胞亚群和普通A549细胞行microRNA芯片筛选，得到两群细胞之问的差异miRNA分子表达情况，其中选出10个兴趣分子进行定量PCR的验证。4．为了加强与临床之间的联系，免疫荧光观察富集得到的细胞亚群是否存在于肺腺癌的手术组织中；利用磁珠分选技术获取这群细胞，定量PCR进一步验证细胞株上得到的结果，缩小并圈定后续研究的miRNA分子范围。结果1．普通A549细胞消化后用干细胞培养基诱导成球状生长，传代培养至第二代，加入紫杉醇处理48h后换以新鲜

6、干细胞培养基，可见大部分成球生长的细胞裂解，仅有极少数的细胞克隆存活；视细胞的生长状态进行离心换液，大约经过两周的时间，残存的细胞能重新恢复克隆生长。2．恢复克隆生长的细胞在体外能连续传代，收集第四代细胞球进行流式细胞检测发现CDl331CD326双阳性率约86％；免疫荧光直观看到绝大部分细胞成CDl33／CD326阳性；分化培养基条件下，球状细胞能贴壁生长，在第六天其外形与普通A549细胞基本相似并表达分化抗原CK8或CKl8；定量PCR显示富集细胞亚群表达更高的干细胞相关标记物包括OCT-4，Nanog，Nestin，CDl33和CD326；裸鼠成瘤实验证实1x1041m

7、lCDl33+／CD326+细胞即可成瘤，而相应lO倍的普通A549细胞未能成瘤。3．分析microRNA芯片发现富集细胞业群与普通A549细胞比较共有14个miRNAs明显上调及36个miRNAs明显下调：挑选与肿瘤发生、侵袭迁移、转化及耐药的可能相关的异常表达的miRNAs分子，如miR一29a，miR一29b，miR一17，miR一125，miR一183，miR一127—3p，miR一520h，miR．663，miR．18b和商R．155等10个分子进行定量PCR验证。4．在病理证实的术后肺腺癌组