猪链球菌2型对氟喹诺酮类抗生素耐药性机制研究

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1、广西大学硕士学位论文猪链球菌2型对氟喹诺酮类抗生素耐药性机制研究姓名：何彩美申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：胡庭俊；杨威20120522猪链球菌2型对氟喹诺酮类抗生素耐药性的机制研究摘要猪链球菌病是当今世界养猪业的主要细菌传染病之一。最普遍的致病性血清型是2型，能引起猪的败血症、心内膜炎、脑膜炎、脓毒性关节炎、肺炎等，感染人类会引起败血症、心内膜炎和脑膜炎，严重会导致死亡。氟喹诺酮类药物是临床上广泛应用于治疗细菌感染的一类高效、广谱的人工化学合成药物，也是猪链球菌病的有效治疗药物之一，但是由于人医和兽医在临床上长期广泛使用以及不合理应用，其耐药性也随之产生

2、并且逐渐增强。猪链球菌2型(SS2)对氟喹诺酮类药物的耐药机制很少有报道。为了探讨SS2耐氟喹诺酮类药物的机制，本研究对4株对诺氟沙星和恩诺沙星敏感的SS2进行诺氟沙星和恩诺沙星的耐药诱导，通过体外耐药诱导，将诺氟沙星和恩诺沙星的MIC提高至256lag／mL。通过研究亲本株和各自诱导至高度耐药菌株的DNA旋转酶(gyrA)和拓扑异构酶IV(parC)的氟喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)氨基酸变异情况、耐药菌株外排泵检测、耐药质粒的检测和消除、耐药质粒能否接合转移到大肠杆菌等方面探讨SS2耐氟喹诺酮类药物的机制。本试验还研究了耐不同氟喹诺酮类药物的SS2是否有交叉耐

3、药性以及SS2在获得耐药性以后，其毒力和致病性是否会发生改变，为防治SS2提供理论依据。利用PCR方法从15株临床分离的猪链球菌菌株中扩增出6株为SS2，占分离总菌数的40％。通过微量稀释法测定了恩诺沙星和诺氟沙星对6株菌株的MIC，结果有4株对这两种药物敏感，2株耐药。采用体外递增药物浓度的方法对4株敏感株分别进行人工诱导产生恩诺沙星和诺氟沙星的耐药性，结果成功诱导出高度耐药菌株8株，两种药物对各自所诱导出来的菌株MIC为256lag／n1L。应用PCR方法对SS2敏感株和耐药株的gyrA和parC基因QRDR进行扩增、测序分析，结果发现75％的人工诱导耐药菌株(6

4、／8)在parC的QRDR发生E83的突变，其他位点无共同性变化；在gyrA中，氨基酸的变化也无共同性，说明本试验诱导的耐药菌株，其药物作用靶基因的靶位突变不是细菌高度耐药的主要原因。检测耐药菌株质粒存在后，进行耐药质粒接合转移和消除试验。耐药质粒的接合转移试验结果显示，大肠杆菌DH5。没有获得SS2的耐氟喹诺酮类药物质粒；应用SDS．温度交替法对耐药菌株进行质粒消除后，耐药菌株对恩诺沙星和诺氟沙星的敏感性均有显著增加，对耐药质粒消除试验后的菌株进行质粒的提取，发现耐药菌株的质粒片段均有丢失。耐药菌株的交叉耐药性试验结果表明耐不同氟喹诺酮类药物的SS2之间存在着氟喹诺

5、酮类药物的交叉耐药性。耐药菌株的外排泵初步检测试验结果显示，不同浓度的外排泵抑制剂氰氯苯腙(CCCP)分别与恩诺沙星、诺氟沙星联合应用后，都能显著恢复耐药菌株的药物敏感性。细菌毒力因子表型检测和小白鼠致病性试验结果显示，亲本株和各自诱导耐药菌株的毒力基因表型没有发生变化；对小白鼠的致病性也未发生改变，表明猪链球菌2型的毒力和致病性不会因为耐药性的产生而降低或加强。关键词：猪链球菌2型氟喹诺酮类药物耐药机制诱导性耐药STUDYONMECHAMSMOFDRUGRESISTANCEOFSTREPTOCOCCUSSUISSEROTYPE2AGAINSTFLUOROQUINOL

6、ONESABSTRACTStr印tococc“ss“括isoneofbacterialinfectiousdiseasesonpighusbandryintoday’sworld．Themostcommonpathogenicserotypeistype2，、Ⅳhichcancausesuchassepticemia，endocarditis，meningitis，septicarthritis，pne啪。niaandab。rti。n。fpigs．Thegermcancausesepticemia，endocarditisandmeningitis，evendeath

7、incaseofseriousnessifitinfectshumanbeings·Thefluoroquin。l。nesareaclass。fbroad—spectrum，potentsyntheticdrugs。fchemosynthesis；ithasbeenwidelyusedforaVariety。fbacterialinfecti。ninclinicalpractice。whichisconsideredtobeeffectivetherapyforS仃eptococc撕suis．However，itsdrugresistancewill